Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

Het doel van dit experiment is om het gen of de genen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantorganellen. Dit wordt bereikt door eerst ethylmethaansulfonaat als chemisch middel toe te voegen om zaden te muteren die de fluorescerende marker voor organellen dragen. De tweede stap is het verzamelen van zaden van individuele planten uit de eerste mutante generatie om lijnen van de daaropvolgende mutante generatie M2 te kweken.

Vervolgens worden de mutagenen van de Eliana-zaden geobserveerd met een confocale of fluorescentiemicroscoop om het aberrante organale fenotype te identificeren. De laatste stap is het genereren van de derde mutagene generatie en het bevestigen van de aanwezigheid van het mutante fenotype. Uiteindelijk kan de recessieve mutatie in kaart worden gebracht met behulp van next-generation sequencing-instrumenten.

Zodra de locatie van het gemuteerde gen is geïdentificeerd, zou transformatie met het wildtype-gen het aberrante organelfenotype moeten herstellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over het behoud van de morfologische en functionele integriteit van plantenorganellen. Atil methanes, sulfonatbehandeling van atop sta-zaden induceert cytosine-timingveranderingen in het genoom, wat resulteert in cytosine gwan naar timing.

Het toevoegen van mutaties. EMS-behandeling is een cruciale stap in dit protocol om een optimale mutatieverhouding binnen M2-individuen te waarborgen. Begin met het verkrijgen van Arabidopsis-zaden van het wilde type Columbia-ecotype die vooraf zijn genetisch gemodificeerd om een relevante fluorescente organelmarker te dragen.

Breng 0,8 gram of ongeveer 40.000 zaden over naar een falcon-buis van 50 milliliter. Voeg vervolgens 25 milliliter gedestilleerd water en 0,2% ethylemethaansulfonaat toe. Incubeer het mengsel 16 uur op een muterende menger op lage snelheid. Aspireer na incubatie de vloeistof en gooi deze weg in een kolf met een molaire oplossing van natriumhydroxide.

Om de EMS te inactiveren, voegt u 25 milliliters water toe aan de Falcon-buis met de zaden. Sluit de buis en keer deze vijf keer om om de zaden te wassen. Nadat alle zaden zijn bezonken, zuigt u het water af en gooit u dit in de kolf met één molair natriumhydroxide.

Herhaal deze wasstap tot 10 keer; na de laatste wasbeurt worden de zaden in een minimale hoeveelheid water gesuspendeerd. Ga over tot sterilisatie van de zaden door 25 milliliters 10% bleek toe te voegen en 30 seconden krachtig te schudden. Zodra de zaden naar de bodem zakken, wordt de bleek afgegoten en worden de zaden gespoeld met 25 milliliters steriel water.

Voeg na het verwijderen van het steriele water 25 milliliters 70%ethanol toe. Schud de buisjes gedurende 30 seconden en laat de zaden naar de bodem zakken. Giet de ethanol af en spoel met 25 milliliters steriel water.

Herhaal het wassen met steriel water twee keer. Giet de zaden vervolgens in een plastic Petrischaal met filterpapier van drie mm. Laat de zaden onder de zuigkast drogen nadat de zaden twee dagen bij vier graden Celsius zijn geïncubeerd.

Plaats de zaden in een Petrischaal van 150 millimeter, met ongeveer 250 tot 300 zaden per plaat, in half Magi and scoog medium dat fighter gel bevat als geleringsmiddel. Kweek de zaden van de M1-generatie gedurende twee weken op de platen. Transplanteer de zaailingen naar de bodem en laat de planten verder groeien.

Na 30 tot 45 dagen bereiken de plantenHet volwassen stadium, waardoor lekken duidelijk zichtbaar zijn. Verzamel op dit punt twee zaden van individuele M1-planten om 1000 onafhankelijke M2-lijnen te genereren. Om de zaailingen met een confocale of fluorescentiemicroscoop te kunnen observeren, worden 60 zaden van elke M2-lijn gedurende zeven tot 10 dagen op plastic Petrischalen in halve medium gekweekt.

Kweek op Moreish en scoog medium met fighter gel ook vijf zaailingen van de onbehandelde EMS-controle op dezelfde plaat. Zodra de zaailingen zijn volgroeid, monteer vijf tot 10 cos-lead-ins met de ABAC-afdichtingszijde naar de 40x lens op een objectglas en sluit deze af met een dekglas; observeer onder fluorescentie elke oleïne van de corticale naar de mediale regio op een gewijzigde subcellulaire distributie van de organelmarker. Na transplantatie van positieve planten in de bodem en het kweken van de zaailingen zoals zojuist beschreven, bevestig dat het mutantfenotype aanwezig is in de M3-generatie.

Verwijder de contaminerende achtergrondmutaties door ten minste drie keer terug te kruisen naar een wild-type genoom dat de gewenste organellaire fluorescente marker bevat, zoals beschreven in het geschreven protocol. Gebruik voor het begin van de mapping een cogen DN Easy Z plant mini kit om ongeveer drie micrograms genomisch DNA te extraheren uit M drie, wat het homozygote mutante Columbia DNA vertegenwoordigt. Dien dit DNA in voor sequencing met een Illumina genome analyzer twee 14.

De volgende stap is om de zago-mutante Colombia te kruisen met Las Berger om, na zelfbestuiving, nakomelingen te genereren waarin de combinatie kan plaatsvinden. De resulterende tweede generatie dient uiteindelijk als een mappenpopulatie die het gen van belang bevat dat de mutatie veroorzaakt. Door het genomische DNA van deze populatie te vergelijken met het genomische DNA van wild-type planten, kan de locatie van de mutatie in het genoom worden geïdentificeerd.

Verzamel na de groei van de F₂-planten tussen de 70 en 100 F₂-individuen die het aberrante fenotype vertonen en een gelijk aantal F₂-planten met een wild-type fenotype; neem van elke plant een bladschijf af met een stansapparaat. De bladschijf dient te worden genomen van bladeren van dezelfde leeftijd. Om gelijke hoeveelheden DNA te waarborgen, kunnen de monsters afzonderlijk of in groepen worden verwerkt voor genomische extractie.

In dit geval is het mogelijk om vijf tot 10 monsters per Eppendorf-buis te verzamelen, zodat er minder buizen zijn waaruit genomisch DNA geëxtraheerd moet worden. Gebruik de MasterPure Plant Leaf DNA Purification Kit om het genomische DNA te extraheren. Het uit elk monster verkregen genomische DNA kan vervolgens met een NanoDrop worden gekwantificeerd.

Combine vervolgens gelijke hoeveelheden DNA van elk monster tot een totaal van 300 nanogram, waarbij mutante en wildtype monsters gescheiden blijven voor de labelingsreactie. Voeg eerst 60 microliters van een 2,5 x random primer-oplossing en 42 microliters water toe. Na het denatureren van het DNA bij een temperatuur van meer dan 95 °C gedurende vijf tot 10 minuten, worden de monsters op ijs geplaatst om het DNA te denatureren. Voeg 15 microliters 10 X dNTPs toe.

Meng met biotinylated DCTP en vul aan tot drie µL met polymerase. Incubeer de monsters gedurende de nacht bij 25 °C.

Voeg de volgende dag 15 µL 3 M natriumacetaat en 400 µL koude 100% Ethanol toe. Incubeer de gemengde monsters één uur bij -80 °C, gevolgd door centrifugatie bij 20.500 ×g gedurende 15 minuten. Was de pellet met 500 µL koude 75% ethanol na een tweede centrifugeerstap.

Droog de DNA-pellets 10 minuten lang bij 37 °C. Resuspendeer de pellets in 100 µL water en gebruik 5 µL om de opbrengst en kwaliteit op een gel te controleren. Random labeling-reacties werden geladen op een 1% agarosegel vanuit een pool van wild-type F2-planten en vanuit een pool van mutante F2-planten.

Stuur als laatste stap 95 µL van de labelingsreactie van het wildtype en de mutant voor genchip arabidopsis ath one genoomarray-hybridisatie. Nadat de scanner de array heeft gescand, worden de resulterende dot CL-bestanden geanalyseerd met onze software. Open na het installeren van onze software het programma en plak de bioconductor-string die in de schriftelijke procedure staat.

Druk vervolgens op de entertoets, waarna de standaard BIOCONDUCTOR-pakketten van de website voor array-genotypering en mapping worden geïnstalleerd. Download en pak de in de tekst vermelde bestanden uit in een nieuwe map op het bureaublad. Bewaar de verkregen gegevens van het gene chip-experiment in wild type C, L en mutant C. Kopieer nu de gene chip-gegevens voor wild type C en mutant C naar de map.

Open vervolgens R voor een pc. Klik op bestand en daarna op map wijzigen. Selecteer de map waarin de bestanden staan, klik op bestand, laad de werkruimte en selecteer vervolgens A one V five R data open read C do R met behulp van Kladblok en kopieer de volledige tekst naar R voor een mac, klik op mis en klik daarna op werkmap wijzigen.

Selecteer de map waarin de bestanden staan. Klik op workspace load workspace file en selecteer ATH one V five R data. Open op dezelfde wijze zowel SFP R als MAP R met een teksteditor en kopieer de tekst naar R in het consolevenster.

Er verschijnt een bericht om genen te zoeken in de Arabidopsis information resource of TAIR. Kopieer de link in de tekst en plak deze in de internetbrowser. Er verschijnt een venster waarin wordt gevraagd om het bestand te openen of op te slaan.

Selecteer opslaan. Kies een bestandsnaam en voeg de extensie toe. Voer x ls uit.

Klik vervolgens op opslaan. Hier wordt een typisch verwacht resultaat getoond. Na analyse van de gegevens verkregen uit de gene chip Arabidopsis H one genome array, stelt deze figuur een voorbeeld voor van de mapping van de Columbia zero mutatie met behulp van de gene chip Arabidopsis, een H one genome hybridisatie, waarbij de horizontale balken de detectiedrempels vertegenwoordigen.

De mutatie in dit voorbeeld bevindt zich op chromosoom één, afgebakend door verticale strepen. Open het bestand dot XLS om de coördinaat van de mutant binnen het in kaart gebrachte gebied te vinden. Identificeer in de geassembleerde Illumina-reads van het genoom van de mutant specifieke EMS-transities tussen de enkelnucleotide-polymorfismen.

Zodra de methode onder de knie is, kan de in dit protocol beschreven aanpak worden gebruikt om genen in een korter tijdsbestek in kaart te brengen in vergelijking met de klassieke mappingmethode.