Met behulp van RNA-gemedieerde interferentie voerstrategie om te screenen op genen die betrokken zijn Lichaam Grootte verordening in de nematode

Deze video demonstreert een procedure voor het identificeren van genen die de groei en lichaamsgrootte van C. elegans reguleren. Voor het inactiveren van kandidaatgenen met behulp van RNA-interferentie (RNAi) worden eerst platen voorbereid met bacteriën die dubbelstrengs RNA tot expressie brengen dat gericht is op de genen van belang. Hermafrodieten in het vierde larvale stadium worden vervolgens overgebracht naar de RNAi-platen.

Zodra ze het stadium van jongvolwassene bereiken, worden ze overgebracht naar nieuwe RNAI-plaatjes om eitjes te leggen. Na enkele uren worden ze verwijderd, waardoor gesynchroniseerde populaties embryo's achterblijven. In het gewenste ontwikkelingsstadium wordt het nageslacht verzameld en op objectglazen gemonteerd.

Ten slotte worden microscopische beelden van de wormen verkregen. Analyse van het beeld toont veranderingen in de lichaamsgrootte aan die zijn veroorzaakt door geninactivatie. Hoewel deze methode kan worden gebruikt om regulatoren van het TGF beta-signaleringspad te identificeren, kan deze ook worden toegepast op andere signaleringspaden die de postembryonale ontwikkeling bij Caenorhabditis elegans reguleren, zoals het insulinesignaleringspad.

Begin deze procedure door de doelgensequenties te kloneren in vector L 4 4 4 0 A, een veelgebruikt worm RNAi-plasmide, en transformeer het recombinante plasmide in de bacteriële stam HT one 15 DE three culture. Kweek de getransformeerde bacteriën op LB-agarplaten met 25 µg/mL carbenicilline en 12,5 µg/mL tetracycline, en selecteer vervolgens een enkele kloon voor toekomstig gebruik.

Transformeer ondertussen de lege vector L 4 4 4 0 in de bacteriële stam HT one 15. Om deze als controle voor de experimenten te gebruiken, worden de getransformeerde bacteriën gedurende één nacht bij 37 °C gekweekt in één milliliter LB-bouillon met 100 µg/mL ampicilline.

Tetracycline wordt niet toegevoegd omdat dit de RNAI-efficiëntie verlaagt. Voeg nog vijf milliliter LB-bouillon met 100 µg/mL ampicilline toe aan de overnight-kweek en incubeer deze vervolgens nog vier tot zes uur bij 37 °C. Zodra de kweek gereed is, wordt 0,5 milliliter van de experimentele of controlebacteriën geënt op de RNAI-wormplaten die zijn gelabeld met de overeenkomstige kloonnaam.

Er moeten minstens twee platen per conditie worden voorbereid. Incubeer de platen overnacht bij 37 °C. De volgende dag.

Er moet een bacteriegaz aanwezig zijn dat RNAi tot expressie brengt, met of zonder de doelgensequentie. De dieren zullen de bacteriën als voedselbron gebruiken. Zodra de RNAI-voedingsplaten gereed zijn, wordt de punt van een platina draad door middel van vlamsterilisatie gesteriliseerd.

Gebruik vervolgens de platina draad om zes tot tien C. elegans hermaphrodieten in het vierde larvale stadium of L4 naar elke RNAi-plaat over te brengen. Laat de hermaphrodieten gedurende de nacht groeien bij 20 °C. De volgende dag zullen de dieren jonge volwassenen zijn.

Breng ze over naar een nieuwe, op de juiste wijze gelabelde en geprepareerde RNAI-plaat. Incubeer de platen bij 20 °C gedurende vier tot zes uur zodat de volwassenen eitjes kunnen leggen. Verwijder na de incubatie alle volwassenen van de plaat om de nakomelingen te synchroniseren.

Zodra de volwassen dieren zijn verwijderd, begint de tijdmeting. Dit is tijd nul. Incubeer de platen bij 20 °C om de dieren te laten groeien tot het gewenste ontwikkelingsstadium.

Hier worden jonge volwassen dieren geselecteerd voor fenotypische analyse. Voor knockdowns die zich in een normaal tempo ontwikkelen, is een incubatie van 72 uur vereist. Houd er rekening mee dat verschillende genen de ontwikkeling van het dier op verschillende manieren beïnvloeden, waardoor de incubatietijden mogelijk moeten worden aangepast.

Als de RNAi ervoor zorgt dat de dieren met een andere snelheid groeien, kunnen jonge volwassenen worden geïdentificeerd als dieren die niet meer dan 24 uur na het L4-stadium zijn, met een voltooide VUL-ontwikkeling en twee tot zes embryo's in de uterus, zoals hier wordt getoond. Om andere ontwikkelingsstadia te identificeren, dient de onderzoeker de gonadale en VUL-ontwikkeling als leidraad te gebruiken. Zodra de dieren het juiste stadium hebben bereikt, kan men zich voorbereiden op het scoren van de fenotypen van de lichaamsgrootte van de met RNAi behandelde wormen.

Plak vervolgens twee lagen gekleurde labeltape op een glazen objectglas van één millimeter dik, zoals hier getoond. Maak twee van deze objectglazen. Plaats daarna een nieuw objectglas tussen de twee glazen met de tape en breng een druppel 2% Agros gesmolten in water aan.

Druk in het midden van het nieuwe glazen dekglas een tweede glazen dekglas bovenop om een dunne agros-pad te maken. Zodra de agros is gestold, verwijdert u het bovenste glas. Het glazen dekglas met de agros-pad is nu klaar voor het aanbrengen van de wormen.

Label het objectglas met de naam van de kloon. Voeg 10 µL 25 mM natriumazide toe aan het aros-kussen. Breng vervolgens, zoals eerder gedaan met een platina draad, 30 tot 40 dieren over naar de natriumazide-oplossing.

Om ze te immobiliseren, plaatst u er een dekglas bovenop. Doe dit voor zowel de recombinante als de lege L 4 4 4 0 RNAi-behandelde dieren. Plaats vervolgens de micrometerglaasje onder de dissectiemicroscoop met een 2,5 x objectief.

Leg met Q Capture of vergelijkbare software een afbeelding van de micrometerliniaal vast en sla deze op. Plaats vervolgens de wormen onder de microscoop en maak afbeeldingen. Om eerst de lichaamslengte te meten, opent u de afbeelding van de micrometerliniaal in de Image Pro-software.

Klik vervolgens op measure en kies calibration. Selecteer daarna de spatial Calibration wizard met de optie calibrate the active image geselecteerd. Klik op next.

Voer de naam voor de kalibratie in en zorg ervoor dat de eenheden voor de ruimtelijke referentie op microns zijn ingesteld. Vink vervolgens de knop 'Referentiekalibratie maken' aan en klik op Volgende. Klik op 'Referentielijn tekenen'.

Er verschijnt een referentieschaalbalk. Verplaats de schaalbalk zodat deze overeenkomt met de uiteinden van de micrometer. Geef vervolgens aan dat de referentie 1000 eenheden representeert.

Klik op ok. Vervolgens op volgende en voltooien. Zodra de software is gekalibreerd, opent u een afbeelding van een worm.

Select vervolgens onder het menu 'measure' de optie 'calibration' en klik daarna op 'select spatial'. Selecteer in het vervolgkeuzemenu de bestandsnaam die is aangemaakt voor de micrometerkalibratie. Selecteer vervolgens onder het menu 'measure' de optie 'measurements' in het venster dat wordt geopend.

Selecteer het instrument voor vrije tekening en trek met de computermuis een lijn door het midden van het lichaam van het dier, van kop tot staart. De lengte wordt in het venster weergegeven. Herhaal dit proces voor alle dieren in het veld.

Exporteer de lengtemetingen naar een Microsoft Excel-bestand of een andere geschikte statistische software. Analyseer de gegevens door het gemiddelde en de standaarddeviatie voor elk monster te berekenen. Vergelijk vervolgens de resultaten voor elke groep met behulp van een student t-toets.

Het eiwit DBL one uit de transforming growth factor bèta of TGF-bèta SUPERFAMILIE is vereist voor de activering van het TGF-bèta-pad. Als reactie op signaalactivering transloceren intracellulaire smad-signaaltransductoren naar de nucleus en initiëren zij gentranscriptie. Zie dat organismen waarin het TGF-bèta-pad is verstoord een kleinere lichaamsomvang hebben, waaronder een kortere lichaamslengte dan wild-type dieren.

Zo worden screenings voor C. elegans uitgevoerd. Mutanten met een afwijkende lichaamsgrootte zijn in staat om TGF-beta-signaleringscomponenten en modifiers te identificeren om de effectiviteit van RNAi via voeding te testen voor de identificatie van lichaamsgrootte-mutanten. RNAi werd gebruikt om DBL-1-routecomponenten SMA-3 en SMA-6 uit te schakelen in vier verschillende stammen van C. elegans.

De geteste C. elegans-stammen omvatten twee die hypersensitief zijn voor RNAi, namelijk Lin-15 B en RF3, evenals de standaard wildtype-stam N2 en de LIN-36-stam, waarvan de RNAi-gevoeligheid vergelijkbaar is met die van N2, zoals hier wordt getoond. Wanneer de expressie van SMA-3 of SMA-6 werd verstoord, vertoonden de dieren een significant kortere lichaamslengte dan de controledieren, behalve bij SMA-6 RNAi in Lin-36. Achtergrond in RF3.

De lichaamslengtes van jonge volwassenen na RNAi-behandeling waren 84 tot 95% van die van de vector alleen. In A one Lin 15 B waren de lichaamslengtes van jonge volwassenen na RNAi 68 tot 86% van die van de controledieren. De A one lin 15 B-stam produceert echter weinig nakomelingen.

Dit maakt ze ongeschikt voor screening op grote schaal. Daarom wordt het gebruik van de RF three-stam aanbevolen voor deze technieken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe genen die de groei en lichaamsgrootte reguleren kunnen worden geïdentificeerd met behulp van de RNI-interferentietechniek.