Het analyseren van cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie

Om de cellulaire mechanismen van internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën te analyseren via multispectrale imaging flowcytometrie. Macrofagen worden eerst voorbehandeld met cytochalasin D om actinpolymerisatie te remmen. Nanodeeltjes of Salmonella worden toegevoegd aan de macrofaagmonolaag en geïncubeerd.

Vervolgens worden de macrofagen geoogst, gefixeerd en gelabeld voor analyse met een imagestroom. Met een multispectrale imaging flowcytometer worden cellen die nanodeeltjes en/of salmonella hebben geïnternaliseerd onderscheiden van cellen met aan het oppervlak gebonden nanodeeltjes en/of salmonella. De resulterende gegevens geven aan dat zowel salmonella als nanodeeltjes alleen worden geïnternaliseerd door cellen die niet zijn behandeld met cyto klain.

D suggereert dat internalisatie actine-afhankelijk is. Deze techniek biedt verschillende voordelen ten opzichte van bestaande methoden zoals flowcytometrie en confocale microscopie. In het bijzonder biedt het een nauwkeurige meting van fluorescentiesignaalintensiteiten en ruimtelijke resolutie tussen verschillende cellulaire kenmerken bij hoge snelheid.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen voor zowel onderzoek naar biomaterialen voor vaccins en geneesmiddelentoediening als voor studies naar de interactie tussen gastheer en pathogeen. Dit omvat het in kaart brengen van de internalisatiepaden die worden gebruikt door polyanhydride-nanodeeltjes en bacteriën. Over het algemeen hebben personen die onbekend zijn met deze methode vaak moeite met de uitvoering.

Het is belangrijk om tijd te besteden aan het titreren van de kleurstoffen om optimale fluorescentiesignalen te verkrijgen. Daarnaast kost het tijd om vertrouwd te raken met de software en om analysetemplates te maken. We kregen oorspronkelijk het idee voor deze methode toen we ontdekten dat poly hydro nanodeeltjes kenmerken vertonen die lijken op die van pathogenen tijdens het gebruik van microscopie en andere technieken.

Vervolgens wilden we een high-throughput systeem gebruiken om de internalisatieprocessen van salmonella en de pollen hydride-nanodeeltjes te vergelijken voorafgaand aan het uitvoeren van de assay. Alle zoogdier- en bacteriële celculturen moeten worden geoogst en de nanodeeltjessuspensies moeten worden voorbereid. Begin met het oogsten van confluente RAW 264.7-cellen met behulp van een celscraper.

Bepaal het aantal cellen met behulp van een hemocytometer. Zaai de cellen vervolgens uit in een 24-well kweekplaat met een dichtheid van vijf keer 10⁵ cellen per well in 0,5 mL compleet DMEM en incubeer deze gedurende de nacht bij 37 °C in een 5% CO2-incubator.

Om de salmonella-tarica voor te bereiden, wordt salmonella verdund in C-D-M-E-M om een multiplicity of infection van 100 per RA W2 64.7-cellen te verkrijgen in een glazen kweekbuis met autoclaafschroefdop van 16 bij 125 millimeter. Weeg vervolgens met steriel weegpapier 5 mg af van de met 1% FITC geladen polyanhydride-nanodeeltjes, geproduceerd zoals beschreven door rean en collega's in hun publicatie uit 2009 in pharmaceutical research, in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg de nanodeeltjes toe aan 0,5 milliliter koude phosphate buffered saline en plaats dit op ijs.

Houd de buis op ijs. Gebruik een ultrasone vloeistofprocessor met een microtip om de suspensie ongeveer 25 seconden te sonceren bij vier tot zes joule. Nu alle benodigde cellen en reagentia gereed zijn, kan de fagocytose-assay worden uitgevoerd.

Label 24-well weefselkweekplaten met gekweekte RA W2 64.7-cellen ter voorbereiding op de assay op de eerste plaat. Elk van de volgende monsters wordt in triplikaat geanalyseerd: cyto en D met nanodeeltjes, cyto en D met salmonella, medium met nanodeeltjes, medium met salmonella, nanodeeltjes alleen, salmonella alleen, en AF six 60-gekleurde cellen alleen. Controles bij 4 °C worden geanalyseerd op de tweede plaat en omvatten medium plus nanodeeltjes en medium plus salmonella. Incubatie bij deze lage temperatuur vertraagt cellulaire processen zoals fagocytose. Voeg één uur vóór inductie 5 µg/mL cyto en D in C-D-M-E-M toe aan de juiste wells en incubeer de cellen bij 37 °C.

Vortex na de incubatie de nanodeeltjessuspensie en voeg 10 µL toe aan de betreffende wells. Vortex vervolgens de salmonella en voeg deze toe aan de betreffende wells met een MOI van 100. Tik een paar keer tegen de plaat om te mengen.

Plaats vervolgens de monsterplaten bij 37 °C en de negatieve controleplaten bij 4 °C gedurende 45 minuten. Plaats de platen na de incubatie op ijs en was de cellen twee keer met ijskoud PBS zonder calcium en magnesium door het oude medium af te zuigen en weg te gooien om ongebonden deeltjes, salmonella en dode of losgekomen cellen te verwijderen. Gebruik van petal magnesium.

Het voorbehandelen met PBS is in dit stadium essentieel omdat het de loslating van de cellen van het substraat vergemakkelijkt. Voeg om de cellen te oogsten 250 µL ijskoud PBS toe en schraap de wells voorzichtig schoon; pipetteer de geoogste cellen in gesiliconiseerde microcentrifugebuisjes met snap-cap en bewaar deze op ijs. Was de cellen door één mL koude wasbuffer toe te voegen en centrifugeer vervolgens 10 minuten bij 250 ×g bij 4 °C. Gooi na het verwijderen van het supernatant de resterende buffer weg door de omgekeerde microcentrifugebuis op papier te tikken.

Resuspend de celpellet door de microcentrifugebuis voorzichtig over een reageerbuisrek te bewegen. Voeg ter fixatie van de cellen 100 µL 4% paraformaldehyde in PBS toe en laat de cellen 15 minuten staan. Was de cellen bij kamertemperatuur door één mL perm-wasbuffer toe te voegen, en centrifugeer vervolgens 10 minuten bij 250 ×g bij 4 °C.

Nadat het supernatant is afgegoten, wordt de resterende buffer zoals eerder beschreven verwijderd. Vervolgens worden de RA W2 64.7-cellen gekleurd. Voeg voor actine 100 µL perm wash buffer toe die Alexa Fluora foid in six 60 bevat gedurende 15 minuten.

Bij kamertemperatuur moeten de ongekleurde monsters worden geïncubeerd met perm, wasbuffer zonder phin. Was na het kleuren de cellen opnieuw en centrifugeer deze, resuspendeer ze vervolgens in 50 µL PBS met 1% PFA en bewaar ze in het donker bij 4 °C tot aan de acquisitie. Zet het systeem aan, start de image stream en start de software op.

Voer de inspiratie en initialisatie van de vloeistofsystemen uit via het bestandmenu. Kies voor het laden van het standaardsjabloon. Selecteer in de galerij met afbeeldingen, via het weergavemenu, alle items en druk op setup uitvoeren om te beginnen met het afbeelden van de beads; pas indien nodig de kerntracking aan om de beelden lateraal te centreren.

Selecteer het brightfield-kanaal en klik op 'set intensity'. Wacht tot de variatiecoëfficiënt van de stroomsnelheid consistent minder dan 0,2% is. Klik in het assistent-tabblad op 'start all' om kalibraties en tests uit te voeren en controleer of deze in de software allemaal zijn goedgekeurd. Klik op 'load sample'.

Plaats vervolgens, wanneer u hiertoe wordt geïnstrueerd, het flacon met het helderste monster. Selecteer een 40 x vergroting wanneer alle fluorochromen zich in de monsterlader bevinden. Zodra de instrumentinstellingen zijn vastgesteld, mogen deze gedurende het gehele experiment niet meer worden gewijzigd.

Schakel elke laser in het experiment in door op de laserpictogrammen in de software te klikken en stel het laservermogen zo in dat elk fluorochroom maximale pixelwaarden tussen de 104.000 counts heeft, zoals gemeten in de scatterplots. Om de verzameling van ongewenste objecten te elimineren, klikt u op het venster voor de celclassificatie in de software. Selecteer vervolgens, om alleen celgegevens te verzamelen, de ondergrens van het oppervlak voor kanaal één voor brightfield en stel de waarde in op 50 micrometers; objecten met een oppervlak kleiner dan 50 micrometers worden beschouwd als debris en worden niet opgenomen.

Selecteer de kanalen die moeten worden verzameld door op de betreffende kanaalpictogrammen in de software hier te klikken. Kanalen 1, 2, 3, 4, 5 en 6 worden geselecteerd onder het tabblad setup. Voer het bestandsnummer en de bestemmingsmap in.

Stel het sequentienummer in op één en het aantal te verwerven events op 5 000. Klik op run, acquire om het gegevensbestand van het eerste experiment te verzamelen en op te slaan. Klik op FLL en voer het volgende experimentele monster uit.

Herhaal dit totdat alle experimentele monsters zijn verzameld. Klik vervolgens op comp settings om de controles uit te voeren. Hiermee worden het bright field en de scatter laser uitgeschakeld en wordt de verzameling van alle fluorescentiekanalen onder het tabblad acquire mogelijk gemaakt.

Wijzig de invoerwaarde naar 500. Plaats vervolgens de controlebuis en klik op run. Voer de acquisitie uit om 500 positieve cellen te verzamelen in de enkelvoudig gekleurde controles.

Herhaal dit voor elk fluorochroom in het experiment om een compensatiematrix op te stellen. Zodra alle monsterbeelden zijn verkregen, start u de ideas-analysesoftware op een aparte analysecomputer door dubbel te klikken op het ideas-icoon op het bureaublad. Dubbelklik op de internalization wizard en laad een van de RIF-bestanden van de testmonsters.

Een pop-upvenster geeft instructies voor het laden van de testbestanden. Volg de instructies en klik op de knop 'volgende'. Klik vervolgens op 'nieuwe matrix'.

Hiermee wordt de compensatie-wizard gestart. Selecteer, wanneer daarom wordt gevraagd, de databestanden voor de enkelkleurcontroles om deze toe te voegen. Klik in de wizard op volgende en volg de instructies totdat het bestand met de compensatiematrix is opgeslagen en is geladen in het vak in stap twee van de internalisatie-wizard.

Klik op volgende en volg de instructies tot er een DAF-bestand is gegenereerd. Stel de weergave-eigenschappen van de afbeelding in door de beeldkanalen te selecteren die tijdens de acquisitie zijn gebruikt. Klik op kanaal twee voor FITC en op kanaal vijf voor AF 660.

Brightfield en side scatter zijn standaard geselecteerd. Selecteer het Brightfield-kanaal O voor het bepalen van de celgrenzen en het kanaal O2 waarin nanodeeltjes of bacteriën zijn verzameld voor de internaliserende probe om de populatie van individuele cellen te definiëren; vervolgens wordt er een scatterplot gegenereerd van het brightfield-oppervlak versus de brightfield-aspectratio van alle cellen. Voor de high-throughput analyse van meerdere databestanden is een sjablonbestand vereist, waardoor het van cruciaal belang is om de gates zorgvuldig te definiëren tijdens het maken van het sjablonbestand.

Elk punt vertegenwoordigt de waarden voor een individuele celafbeelding. Klik op een enkel punt in een grafiek om de afbeelding van die specifieke cel in de afbeeldingsgalerij te selecteren.

Trek vervolgens een gate rond de cellen met het oppervlak en de aspect ratio die overeenkomen met enkelvoudige celgebeurtenissen. Enkelvoudige cellen hebben een aspect ratio van ongeveer 1, terwijl doubletten een aspect ratio van ongeveer 0,5 hebben.

Klik op meerdere cellen om onderscheid te maken tussen de regio met enkelvoudige cellen en die met doubletten of debris. Om een histogram van de root mean square van de brightfield-gradiënt van de brightfield-afbeelding te genereren, klikt u op de knop 'volgende'.

Selecteer vervolgens onder het tabblad populatie de optie 'bin' om de geselecteerde bin weer te geven. Klik op de bins om te bepalen waar de cellen zich bevinden en stel de beste focus in. Begin met het trekken van een lijnregio om de gefocuste cellen te gaten.

Hoe hoger de gradient RMS, hoe scherper de focus; sla de volgende stap over tenzij er andere kleurstoffen zijn waarop gefilterd moet worden. Er wordt een nieuwe scatterplot gegenereerd met de intensiteit van kanaal twee op de x-as tegenover de maximale pixelwaarde van kanaal twee op de y-as. Klik op de stippen en bekijk de beelden om te helpen bepalen welk gebied moet worden omcirkeld voor de cellen die positief zijn voor nanodeeltjes of bacteriën.

Er wordt een histogram van de internalisatie-eigenschap gegenereerd met een regio die bij nul begint, welke moet worden aangepast door de beelden te observeren. De internalisatie-eigenschap is een ratio van de intensiteit binnen de cel ten opzichte van de intensiteit van de hele cel. Deze is geschaald zodat bij een waarde van nul de helft van de intensiteit zich binnenin bevindt.

De wizard heeft voor elke cel een regio gecreëerd die de binnenkant aanduidt door een masker te maken; hiervoor is het celafbeelt-input gebruikt om het celoppervlak te vinden, waarna dit met vier pixels is geërodeerd. Let op dat dit masker indien nodig handmatig kan worden aangepast voor verschillende celtypen door eerst een objectmasker op de brightfield-afbeelding te maken en dit met meer of minder pixels te eroderen. De internalisatie-functie wordt op basis van dit geërodeerde objectmasker berekend met behulp van een algoritme in de software.

Deze functie stelt ons in staat om geïnternaliseerde deeltjes en bacteriën, waarbij het grootste deel van hun fluorescentiesignaal zich binnen de rand van het masker bevindt, te onderscheiden van oppervlaktegebonden deeltjes en bacteriën, waarbij het grootste deel van hun fluorescentiesignaal zich buiten de rand van het masker bevindt zoals in dit voorbeeld wordt getoond; maak een nieuw histogram met een nieuwe internalisatiefunctie op basis van het geërodeerde objectmasker. Teken een regio om de gating voor geïnternaliseerde cellen uit te voeren door de beelden in de geselecteerde bin-modus te bekijken. Stel de gate in op 0.3 hier.

Cellen met een score lager dan 0.3 worden beschouwd als cellen met oppervlaktegebonden partikels. Om cellen met achtergrondlabeling te elimineren en specifiek geïnternaliseerde nanodeeltjes of bacteriën te identificeren, selecteert u kenmerken uit het analysemenu. Klik op het analysemenu.

Klik vervolgens op de functie 'spot count' om het gemiddelde aantal spots aan het statistiekenrapport toe te voegen. Klik in het menu 'reports' op het rapporticoon. Definieer daarna het statistiekenrapport, voeg kolommen toe en selecteer de betreffende celpopulatie.

Klik op oké. De internalisatie-wizard voegt automatisch statistieken toe aan dit rapport om het gegevensbestand op te slaan als sjablonbestand, dat kan worden gebruikt voor batchanalyse van alle experimentele bestanden. Klik op het bestandsmenu en selecteer opslaan als sjabloon.

Sjablonbestanden. Gebruik de extensie .AST om meerdere databestanden te analyseren in de IDEA-software. Klik op 'Tools' en selecteer 'Batch data files' en voer alle RIF-bestanden in.

Voeg het compensatiematrixbestand en het sjabloonbestand toe in de overeenkomstige secties om de batch ter verwerking in te dienen en klik op verzenden. Na de verwerkingsstap worden alle RAF-bestanden geanalyseerd en worden er DAF-bestanden gegenereerd voor elk van de individuele raw-bestanden. Er wordt een eindrapport gegenereerd met statistieken voor alle monsters om het effect van actine-inhibitie en lage temperatuur op de fagocytose van salmonella en nanodeeltjes te vergelijken.

RA W2 64.7-cellen werden geïncubeerd bij 37 °C in medium, met of zonder cytochalasin D, of geïncubeerd in medium bij 4 °C. Zowel de temperatuur als de actinemanipulaties verminderden de internalisatie van zowel de nanodeeltjes als salmonella. Echter, incubatie van de cellen met cytochalasin D verhoogde het percentage cellen met aan het oppervlak gebonden nanodeeltjes, terwijl het percentage cellen met aan het oppervlak gebonden salmonella afnam.

Het percentage cellen dat positief is voor op het oppervlak gebonden nanodeeltjes stijgt van ongeveer 8% bij 37 °C naar meer dan 35% na behandeling met cytochalasin D of bij 4 °C. In contrast hiermee werd het percentage cellen met op het oppervlak gebonden salmonella verminderd van 35% naar 15% na behandeling met cytochalasin D. Incubatie van RAW 264.7-cellen met salmonella bij 4 °C verminderde de internalisatie zonder een schijnbare toename van de hoeveelheid op het oppervlak gebonden bacteriën in vergelijking met de controle bij 37 °C. Samen tonen deze gegevens aan dat salmonella en nanodeeltjes worden geïnternaliseerd via een vergelijkbaar cellulair proces dat actine vereist en temperatuurafhankelijk is.

Bovendien wijzen de gegevens erop dat de aanhoudende hechting van salmonella aan macrofagen actinpolymerisatie vereist. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën kan worden onderzocht met multispectrale imaging flowcytometrie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat inhibitoren cytotoxisch zijn.

Daarom zijn voorafgaande experimenten voor cytotoxiciteitsprofielen noodzakelijk om de optimale concentraties te bepalen. Houd er rekening mee dat het werken met salmonella gevaarlijk kan zijn; voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en het vermijden van de vorming van aerosolen, dienen te worden nageleefd bij het uitvoeren van deze procedure.