Het vervaardigen van een dubbellagige Hydrogel om ASC differentiatie Controle

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van een composietmatrix gemaakt van natuurlijke biomaterialen die kan worden gebruikt voor de afgifte en differentiatie van stamcellen om wondgenezing te ondersteunen. Dit wordt bereikt door eerst adipose-afgeleide stamcellen of een ASC te isoleren uit een proefdier. Vervolgens worden de ASC's geladen op vooraf vervaardigde chitosan-microsferen.

Vervolgens wordt de GEFIBRILLERDE collageengel gegoten, waarna de A-S-C-C-S-M-kraaltjes over de collageengel worden gelaagd. Ten slotte wordt PEG-fibrinegel over de A-S-C-C-S-M-collageengel gegoten en wordt medium toegevoegd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de bidirectionele simultane migratie van A SC vanuit de CSM-kraaltjes naar zowel de collageen- als de PEG-fibrine-matrices aantonen.

Via deze procedure kan één enkele stamcelbron differentiële signalen ontvangen uit de collageen- en PEG-fibrine micro-omgevingen, waardoor deze differentieel wordt gestimuleerd om pleiotrope factoren te produceren en een netwerk van pre-vasculaire structuren te vormen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals composieten van één enkel materiaal of gedecellulariseerde huidvervangers, is dat deze andere producten de revascularisatie van het product door de gastheer niet actief stimuleren. We kregen het eerste idee voor deze methode toen we opmerkten dat geïsoleerde RAD A SE de neiging heeft om te differentiëren naar een vasculair fenotype wanneer deze wordt gekweekt in een varkensfibrine-matrix.

Deze observatie leidde tot het idee dat een enkele stamcelbron gelijktijdig kon worden benut in een systeem dat uit verschillende biomaterialen bestond. Na het isoleren en kweken van adipose-afgeleide stamcellen of ASC's, het prepareren van chitosan-microsferen of CSM's en het laden van de ASC's in de CSM's, wordt een polyethyleenglycol-fibrine-hydrogel bereid door succinylglutamate-gemodificeerde PEG op te lossen in vier milliliters tris-gebufferde zoutoplossing. Gebruik vlak voor het experiment een filter van 0,22 micron om de oplossing te steriliseren.

Meng in een cultuurputje van een zesputsplaat 500 µL fibrinogeen-stockoplossing met 250 µL PEG-stockoplossing en incubeer dit gedurende 20 minuten in een bevochtigde incubator met 5% CO₂ bij 37 °C. Meng vervolgens 250 µL van de eerder bereide A-S-C-C-S-M met de gepegyleerde fibrinogeenoplossing, voeg onmiddellijk 1 mL trombine-stockoplossing toe en tril dit met een pipet snel één of twee keer. Plaats het cel-gelmengsel direct in een twaalfputsplaat en incubeer dit gedurende 10 minuten in een bevochtigde kamer met 5% CO₂ bij 37 °C. Was vervolgens het resulterende PEG-fibrine twee keer met HBSS en incubeer dit in alpha-minimal essential medium aangevuld met 10% FBS in een bevochtigde incubator met 5% CO₂ bij 37 °C, waarbij gedurende een periode van 11 dagen standaard lichtmicroscopische technieken worden gebruikt.

Observeer de migratie van cellen vanuit het CSM in het gelmengsel, A-S-C-C-S-M met type one collageen geëxtraheerd uit rattenstaartpezen met behulp van twee normale natriumhydroxide. Stel de pH in op 6.8 en fibrilleer. Voeg het gefibrilleerde collageen, A-S-C-C-S-M mengsel toe aan een 12-wellplaat en incubeer in een bevochtigde incubator met 5% carbon dioxide bij 37 °C gedurende 30 minuten.

Nadat is gecontroleerd of de fibrillatie voltooid is, worden de collagen A-S-C-C-S-M gels tot 11 dagen geïncubeerd in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius. Observeer gedurende een periode van 11 dagen de migratie van cellen vanuit CSM in de gel met behulp van standaard microscopische technieken om het dubbellaags construct te ontwikkelen, teneinde de migratie- en co-inductie-eigenschappen van een enkele bron van stamcellen te bestuderen. Maak hierbij gebruik van twee bio-scaffolds.

Bereid zowel de collageengel als de PEG-fibrinegel voor met de volgende kleine wijzigingen: bereid één milliliter van 7,5 milligram per milliliter collageen. Draag het mengsel vervolgens over naar een weefelkweekinzetstuk met zes putjes en incubeer dit gedurende 30 minuten bij 37 °C. Na volledige fibrillatie worden 200 microliter van vijf milligram A-S-C-C-S-M in kweekmedium over het collagenoppervlak aangebracht.

Nadat de microsferen op de gel zijn bezonken, wordt de PEG-fibrinegel bereid met 250 µL celkweekmedium. Breng vervolgens de gepegyleerde fibrinogeen-trombineloplossing aan als laag over de A-S-C-C-S-M collageenlagen. Incubeer de constructen na voltooiing gedurende 30 minuten in een bevochtigde incubator met 5% CO2 om volledige stolling te bereiken.

Plaats ten slotte één milliliter medium in de bovenkamer boven het construct en drie milliliter medium in de onderkamer. Karakterisering van een SC ingebed in dit steunstructuur onthulde dat SC's geladen CSM's gelijktijdig tussen een laag collageen en peg-fibrine kunnen worden geplaatst en differentieel signalen van beide extracellulaire omgevingen kunnen ontvangen om te gedijen onder hun nieuwe omstandigheden. Zoals hier getoond, ondersteunde collageen het vermogen van ASC's om stamcellen te blijven, wat werd aangetoond door hun expressie van stro-1 in het groen, evenals hun fibroblast-achtige morfologie.

In tegenstelling hiermee stimuleerde PEG-fibrine de ASC's om te differentiëren naar een avasculair fenotype, zoals blijkt uit hun hier getoonde buisvormige morfologie, inclusief lumen en hun endotheelcelspecifieke expressie van von Willebrand-factor, hier in rood weergegeven. Bovendien, zoals hier aangetoond, leken deze waargenomen fenotypen zich vroeg in de kweek te ontwikkelen en bleven ze gedurende 11 dagen behouden. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u adipose-afgeleide stamcellen van ratten isoleert, deze op chito-microsferen laadt en ze incorporeert in een dubbellaagse hydrogel met behulp van door de FDA goedgekeurde biomaterialen.

Vergeet niet dat de biomaterialen en cellen die in dit protocol worden gebruikt, afkomstig zijn van dieren en mensen en uiterst gevaarlijk kunnen zijn als ze besmet zijn met pathogenen van hun gastheer. Voorzorgsmaatregelen, zoals het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen en aseptische celkweektechnieken, moeten altijd worden getroffen tijdens het uitvoeren van deze procedures.