Aanpassing van Aspergillus niger Morfologie door toevoeging van talk micro-deeltjes

Deze methode genereert en karakteriseert microdeeltjesafhankelijke morfologische structuren van de draadschimmel Aspergillus niger om de schimmelmorfologie te correleren met de productiviteit. Kweek A. niger gedurende 72 uur met of zonder microdeeltjes in een geroerde tankbioreactor van drie liter om de specifieke productiviteit te berekenen. Neem monsters op vastgestelde tijdstippen en bepaal het biomassa-drooggewicht en de betafructosidase-activiteit.

Onderzoek na 72 uur de schimmelmorfologie via microscopie en karakteriseer deze door middel van digitale beeldanalyse. Combineer vervolgens relevante parameters van de beeldanalyse tot een morfologiegetal dat mathematisch correleert met de specifieke productiviteit. Uiteindelijk kan deze methode de morfologie van Aspergillus niger nauwkeurig genereren en uitgebreid karakteriseren voor een beter begrip van de morfogenese van filamenteuze micro-organismen.

Aspergillus niger is al vele decennia een belangrijk industrieel werkpaard in de biotechnologie. Een van de meest intrigerende en vaak onbeheersbare kenmerken van A. niger en verwante soorten is hun complexe morfologie, die varieert van dichte sferische pellets tot viskeuze mycelia, afhankelijk van de kweekcondities. Het belangrijkste voordeel van onze procedure is dat we door de toevoeging van microdeeltjes nu in staat zijn om de schimmelmorfologie specifiek af te stemmen op de procesbehoeften.

Tot nu toe is er geen andere methode beschreven voor een dergelijke aanpassing van de schimmelmorfologie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de kweek van filamenteuze micro-organismen. Voor industriële toepassingen is het immers cruciaal om de schimmelmorfologie te beheersen en daarnaast onderscheid te kunnen maken tussen een goed producerende en een slecht producerende schimmelmorfologie.

Ons protocol biedt de mogelijkheid voor gewenste aanpassing en karakterisering van de schimmelmorfologie. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in de morfologie van Aspergillus niger, kan deze ook worden toegepast op andere filamenteuze micro-organismen, zoals Penicillium- of Streptomyces-stammen. Stel vier bioreactoren in voor steriele culturen, zoals beschreven in het bijbehorende protocol.

Tekst gebaseerd op de toevoeging van micropartikels, kweek aspergillus Niger met verschillende morfologie. Breng na 72 uur monsters van 50 milliliter kweekbouillon over in een Falcon-buis.

Biomassa-monsters dienen ten minste in dubbeltoestelling te worden genomen; weeg na droging in de desiccator een cellulosefilter met de microbalans. Plaats het filter in een Büchner-trechter die is aangesloten op een vacuumpomp met waterstraal; filter 10 milliliter monster, gevolgd door 10 milliliter gedeïoniseerd water om mediumcomponenten uit de biomassa te verwijderen. Vouw het filter eenmaal in het midden.

Plaats het in een glazen petrischaal en in een vacuümdroger tot een constant gewicht is bereikt. Verplaats het filter naar een exsiccaat en laat het afkoelen. Meet vervolgens het gewicht.

Bereken het droge biomassagewicht per liter door bepaling van het gewicht, het verschil tussen de filters en de daaropvolgende deling door het monstervolume voor de glucose-oxidase- en peroxidase-enzymassays. Bewaar monsters op ijs met behulp van een spuit, 1,5 milliliters. Leid de cultuursuspensie door een celluloseacetaatfilter in een reactiebuis voor het uitvoeren van de bèta-fructose-SASE-assay.

Om de statistische robuustheid te waarborgen, voeren we de meting zorgvuldig uit met twee triplicaten. Voeg om de assay te starten 20 µL monster toe aan de reageerbuis; om te controleren op de pH- en temperatuurafhankelijke splitsing van sucrose tot glucose, gebruikt u 20 µL gedeïoniseerd water in plaats van 20 µL monster. Bereid daarnaast voor elk monster een negatieve controle voor residuele glucose in het kweekmedium door middel van de assay.

20 µL hitte-geïnactiveerd monster. Voeg 200 µL sucrose-oplossing 1,65 M toe om de reactie van sucrose naar glucose te initiëren. Bij pH 5,4 en 20 µL monster worden alle reactiebuisjes 20 minuten geïncubeerd in een warmteblok van 40 °C. Stop de reactie door de buisjes eerst op ijs te koelen en vervolgens 10 minuten te verhitten op 95 °C.

Centrifugeer de monsters indien nodig en verdun deze voor de assay zodanig dat de gemeten absorptie binnen het gekalibreerde waardebereik valt. Voeg nu voor elke reactie twee microliters monster toe aan een microtiterplaat. Voer de monstermetingen in triplikaat uit.

Bereid daarnaast een standaardcurve voor met 10 glucose-oplossingen variërend van 1 millimolar tot 15 millimolar. Gebruik voor de nulpuntskalibratie 2 µL gedeïoniseerd water. Voeg vervolgens aan elk van deze 200 µL van de reagensoplossing toe.

Incubeer de plaat 10 minuten bij kamertemperatuur. Meet de absorptie bij 450 nanometer met een 96-well sunrise Microplate reader en de Magellan data retrieval software. Open de resultatentabel in een spreadsheet en stel een kalibratielijn voor de standaardcurve op.

Bereken de activiteit voor elk monster. Bereken vervolgens de bèta-fructosidase-activiteit door de waarden van de bijbehorende negatieve controle van de monsteractiviteit af te trekken. Bereken tenslotte de specifieke productiviteit door het drooggewicht van de biomassa en de bèta-fructosidase-activiteit mee te wegen.

Plaats drie milliliters van de cultuursuspensie in een plastic Petrischaal en verdun deze met een fysiologische natriumchlorideoplossing om de morfologische structuren te scheiden. De kwaliteit van de microscopische beelden is van uitzonderlijk belang. Voor de daaropvolgende beeldanalyse moet tijdens de verdunningsstap zorgvuldig te werk worden gegaan.

Plaats de Petrischaal onder een microscoop die is uitgerust met een geïntegreerde camera. Leg ongeveer 100 beelden van morfologische structuren per monster vast en sla deze op, waarbij wordt gewaarborgd dat op elk beeld ten minste één object volledig in beeld is. Ga op dezelfde wijze te werk met schalen die monsters van verschillende reactoren bevatten, waarbij telkens nieuwe beelden worden vastgelegd.

Let op de verschillende morfologische groeivorm van monsters uit verschillende reactoren die zijn gekweekt met variërende hoeveelheden toegevoegd talkpoeder. Open vervolgens alle afbeeldingen van hetzelfde monster in het beeldverwerkingsprogramma Image J. Gebruik de proces-tool om de afbeeldingen binair te maken.

Zet de afbeeldingen om naar zwart-wit om het commando toe te passen op een volledige reeks afbeeldingen. Gebruik vervolgens een macrocode en open een van de afbeeldingen die een schaalbalk bevatten. Trek een rechte lijn over de schaalbalk om het aantal pixels te bepalen dat overeenkomt met 2000 microns.

Selecteer de analysetool, stel de meting in en kies de vormfactoren: ferrets, diameter area en perimeter. Gebruik een macrocode om een reeks afbeeldingen te verwerken. Open nu het spreadsheet waarin de resultaten van de vormfactorwaarden zijn weergegeven.

Bereken voor elke afbeelding een morfologiegetal voor alle afbeeldingen van één monster. Bereken de gemiddelde waarde voor het morfologiegetal. Gebruik een grafisch en data-analyseprogramma om het morfologiegetal uit te zetten tegen de specifieke productiviteit.

Bepaal de wiskundige relatie via wiskundige regressie door de toevoeging van toenemende concentraties talkmicropartikels. Acht Niger SKAN 10 15. De morfologie verandert van een ware pelletmorfologie naar een gedispergeerde of zelfs my-morfologie, terwijl onder standaardcondities de verwachte pelletmorfologie wordt vertoond.

Interessant is dat de myceliale morfologie wordt bepaald door het medium aan te vullen met 10 gram per liter talkmicrodeeltjes. Tegelijkertijd neemt de activiteit van Beto Fructotase ongeveer drie keer toe; aanvulling met één of drie gram per liter talkpoeder leidt tot een gedispergeerde morfologie met een verdubbelde fructose-activiteit, gebruikmakend van parameters bepaald door automatische beeldanalyse. De microdeeltjesafhankelijke morfologie kan uitgebreid worden beschreven door morfologie.

Let op: perfect ronde, gladde pellets zullen op microscopische beelden als perfecte cirkels verschijnen voor dergelijke deeltjes. Het morfologiegetal heeft een waarde die onder standaardomstandigheden één benadert. De morfologie in reactor één vertoont een morfologiegetal van rond de 0,8.

De morfologie in reactor vier met 10 g/L talkpoeder vertoont een morfologiegetal van rond de 0,1. Het morfologiegetal voor de reactoren twee en drie met talkpoederconcentraties van 1 en 3 g/L ligt tussen deze uitersten, wat wijst op een gedispergeerde morfologie.

Aangezien de morfologie die afhankelijk is van microdeeltjes nauw verbonden is met de productiviteit van bèta-fructosytacellen, bestaat er na de ontwikkeling een goede wiskundige correlatie tussen morfologie, aantal en productiviteit. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de biotechnologie om de schimmelmorfologie verder te onderzoeken, en in het bijzonder de relatie daarvan met de productiviteit. Door deze procedure voor de gedetailleerde creatie van specifieke morfologische schimmelkruistypen te volgen, kunnen andere belangrijke aspecten van kweek van filamenteuze micro-organismen worden verkend.

Myceliale morfologie is bijvoorbeeld bekend als veel viskeuzer dan pelletmorfologie. Daarom wordt de algehele productiviteit van het proces belemmerd door problemen bij de zuivering van het gewenste product. Ons morfologiegetal zal helpen bij het opstellen van modellen met betrekking tot de kweek en protologie, en ons begrip van schimmelmorfologie in het algemeen verder vergroten.