Een handig en algemene uitdrukking platform voor de productie van de uitgescheiden eiwitten uit menselijke cellen

In deze video beschrijven we een tijd- en kostenefficiënte procedure voor de expressie van gesecreteerde eiwitten uit HEC 2 9 3 T-cellen. In eerste instantie wordt een HEC 2 9 3 T-celcultuur met 40% confluentie voorbereid in een six-well plaat. Vervolgens wordt een transfectiemengsel gemaakt door GeneJuice en de testplasmiden te verdunnen in serumvrij medium.

Het transfectiemengsel wordt op de cellen aangebracht, waarna deze worden geïncubeerd bij 37 °C om eiwitexpressie mogelijk te maken. De detectie van eiwit in het supernatant kan worden uitgevoerd via western blot. Zodra een geschikt construct is geïdentificeerd, kan de procedure worden opgeschaald met behulp van 10-laags cel-factories.

Cellen worden getransfecteerd met behulp van PEI als transfectiereagens. Eiwitten kunnen uit de supernatants van de culturen worden gewonnen middels tangentiële stromingsfiltratie gevolgd door affiniteitschromatografie. Uiteindelijk maakt dit platform de expressie mogelijk van een breed scala aan macromoleculen in milligramhoeveelheden.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals baculovirus-gebaseerde expressie in insectencellen, is dat een groot aantal constructen kan worden gescreend en opgeschaald voor expressie, waarbij de resultaten binnen drie weken worden behaald. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Hello Aiden, Shada Zini en Jonathan Cook, drie promovendi uit mijn laboratorium. Begin met het uitplaten van 250.000 HEC 2 9 3 T-cellen per well in een volume van 1 ml in een six-well plate. Voeg 1 ml per well van DMEM toe, aangevuld met 10% FBS en penstrep, en schud de plaat om de cellen gelijkmatig te verspreiden.

Incubeer de cellen vervolgens gedurende de nacht in een bevochtigde 5% koolstofdioxide-incubator bij 37 °C. Zodra de cellen een confluentie van ongeveer 40% bereiken, vervangt u het supernatant door twee milliliters vers medium om het transfectiemengsel voor te bereiden. Pipetteer eerst 90 µL serumvrij DMEM in een Eppendorf-buisje.

Voeg vervolgens drie µL gene juice, het transfectiereagens, toe, meng de inhoud van de buis voorzichtig en incubeer deze vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg daarna 10 µL toe van een stockoplossing van 100 ng/µL van het via miniprep gezuiverde plasmide-DNA dat getransfecteerd moet worden.

Meng de inhoud van de buis en laat deze 15 minuten bij kamertemperatuur staan. Om de transfectie uit te voeren, wordt het mengsel op de HEC 2 9 3 T cellen aangebracht. Schud de plaat voorzichtig, druppel voor druppel, om het transfectiemengsel gelijkmatig te verdelen.

Incubeer de cellen vervolgens bij 37 °C. Voeg 24 uur later 1 mL vers medium toe aan elke well en incubeer nog eens 48 uur. Oogst drie dagen na transfectie het supernatant en bepaal de expressieniveaus van het eiwit van belang via western blot.

Zodra een geschikt construct is geïdentificeerd, kan de transfectieprocedure worden opgeschaald. Vul bij gebruik van 10-laags cell factories een cell factory met 1,2 liter DMEM aangevuld met 5% FBS. Voeg vervolgens 200 miljoen HEC 2 9 3 T-cellen toe, waarbij de cellen gelijkmatig over alle lagen worden verdeeld.

Vier T 225 vierkante kweekflessen met een confluentie van 100% bevatten ongeveer 200 miljoen cellen. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 °C. Bereid het transfectiemengsel in een T 75 fles door 840 µg DNA te verdunnen in 84 mL steriele 1× PBS.

Voeg 2,5 milliliters van een oplossing van één milligram per milliliter polyethyleenimine, of PEI, toe en incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. De oplossing moet troebel worden. Giet vervolgens het transfectiemengsel langzaam in de cell factory en verdeel dit grondig.

Totale lagen. Voeg valproïnezuur toe tot een eindconcentratie van 4 mM. Dit zal de expressieopbrengsten verhogen zodra het transfectiemengsel is toegevoegd.

Incubeer de cultuur gedurende vier dagen bij 37 °C om eiwitexpressie mogelijk te maken. Oogst het medium vier dagen na transfectie en maak de cell-factory onmiddellijk schoon voor hergebruik; centrifugeer het opgevangen medium 30 minuten bij 6 000 G bij 4 °C en filtreer het vervolgens via een steriele cup vacuumfilterapparatuur van 0,22 micron om eventuele particulate materie te verwijderen. Gebruik daarna het CentraMate tangential flow filtratiesysteem om het supernatant te concentreren tot 75 milliliters.

Zodra het supernatant is geconcentreerd, kan het eiwit van belang worden gezuiverd via affiniteitschromatografie. In dit experiment hebben we de HA-getagde subunits van het extracellulaire domein van de menselijke AAL twee receptoren gezuiverd met behulp van het hier beschreven grootschalige systeem, gevolgd door hoge-affiniteit anti-THA chromatografie. Zoals getoond in deze met Coomassie gekleurde SDS-PAGE analyse.

De extracellulaire domeinen van de interleukine twee receptor alfa- en gamma-subunits migreren bij moleculaire gewichten van 40 kilodaltons en 46 kilodaltons. De heterogeniteit van de EnLink-glycanen aanwezig op IL twee R alfa en IL twee R gamma veroorzaakte bandverbreding op de SDS-PAGE-gel. De band met het hogere moleculaire gewicht vertegenwoordigt contaminerende BSA.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u eiwitten kunt tot expressie brengen uit menselijke celculturen met behulp van 10-laagse cell-factories. Vergeet niet dat HEK 293T-cellen als biologisch gevaarlijk worden beschouwd en op biosafety level 2 moeten worden behandeld. Draag altijd geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en desinfecteer oppervlakken volgens de institutionele en overheidsrichtlijnen.