Efficiënte productie en zuivering van recombinant muizen Kindlin-3 uit Insect Cellen voor Biofysische Studies

Het algemene doel van de volgende experimenten is om efficiënt milligramhoeveelheden van Miran Kinlin drie en insectencelcultuur te produceren, die niet kunnen worden geproduceerd in andere expressiegastheersystemen. Dit wordt bereikt door COT-transectie, een KINLIN drie overdrachtsvector samen met een gemodificeerd bao-virus back mid om een recombinant bao-virus te creëren dat het KINLIN drie-gen bevat. Als tweede stap wordt het virus versterkt in insectencellen om voldoende hoeveelheden virionen te produceren voor toekomstige stappen.

Vervolgens worden insectencellen geïnfecteerd om grote hoeveelheden Kinlin drie-eiwit te produceren om ons zuivering via snelle vloeistofchromatografie mogelijk te maken. Resultaten laten zien dat functioneel kinlin drie van hoge zuiverheid kan worden geproduceerd in milligramhoeveelheden op basis van SDS-pagina-analyse en uitsluitingschromatografie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals kindling drie-expressie in bacteriën is dat macular-virus geïnfecteerde insectencelexpressie de recombinante eiwitproductie vertienvoudigt.

De SF negen cellen voor deze procedure worden gekweekt en onderhouden in suspensie met behulp van SF 902-media aangevuld met 100 microgram per milliliter penicilline en 100 microgram per milliliter streptomycine. Voor bao-virusgeneratie moeten de cellen worden gekweekt tot een dichtheidsbereik van vijf keer 10 tot de vijf tot één keer 10 tot de zes cellen per milliliter. Om de SF negen-cellen voor transfectie voor te bereiden, zie ongeveer een keer 10 tot de zes cellen per put van een steriele zes-puts weefselkweekplaat in twee milliliter SF 902-media aangevuld met penicilline en streptomycine. Laat de SF negen-cellen ongeveer 20 minuten op kamertemperatuur in de afzuigkap staan om aan de basis van de plastic putten te hechten en zo een monolaag te vormen. Recombinant bao-virusgeneratie wordt bereikt door COT-transectie plasmide, DNA en BMid DNA op een monolaag SF negen-cultuur.

Het expressievector pAPINE neuron firm T drie heeft het muis KINLIN drie-gen firm T drie. Onder de controle van de P 10 BAO-virale promotor bevat het flankerende bao-virale sequenties om recombinatie met de back mid mogelijk te maken en codeert het een C-terminaal hiss zes-tag voor downstream-zuivering. Voor elke transfectie maakt men een tot twee microgram gezuiverd MFI T drie met 0,5 microgram gezuiverd B mid en 100 microliter SF 902 SFM zonder antibiotica. Dit is oplossing A in een aparte buis, verdun zes microliter cel-effect in twee reagent met 100 microliter SF 902 SFM zonder antibiotica.

Voor elke transfectiereactie kan hier een mastermix worden gemaakt voor verminderde vloeistofbehartiging als er veel transfecties vereist zijn. Dit is oplossing B. Meng de twee oplossingen A en B met ongeveer 200 microliter van elk per transfectie en incubeer op kamertemperatuur gedurende 20 minuten om lipide-DNA-complexen te vormen. Na 20 minuten verdunt u de lipide-DNA-complexen met 800 microliter per transfectie van SF 902 SFM zonder antibiotica. Zuig vervolgens voorzichtig het SF negen-celmonolaagmedia af en pipet de AB-oplossing en mediamixture voorzichtig op de SF negen-monolaag.

Incubeer de getransfecteerde cellen in een bevochtigde incubator bij 27 graden Celsius 's nachts om een ​​bevochtigde omgeving te creëren om te voorkomen dat de cellen uitdrogen. Plaats de zes-putsbak in een plastic gelitineerde container naast een vochtige papieren handdoek. Voeg de volgende dag een extra milliliter SF 900 toe aan SFM zonder antibiotica. Bij elke monolaagcultuur worden de cellen bij 27 graden Celsius gedurende vijf dagen verder geïncubeerd.

Na vijf dagen oogst u het recombinante bao-virus direct uit het kweekmedium en brengt u het over in een schone centrifugeerbuis. Helder eventuele SF negen-celdebris door centrifugatie bij 1000 Gs gedurende vijf minuten. Bij kamertemperatuur brengt u het virus, dat in de resulterende supernamen staat en wordt aangeduid als P een, over in een schone buis. P een-virusgeneratie kan worden verondersteld een verwachte virale titer te hebben van een keer 10 tot de zeven PFU per milliliter.

Hoewel een plaque SA kan worden uitgevoerd indien nodig, bewaar de P een-virale stock bij vier graden Celsius in het donker tot gebruik. De SF negen-cellen die worden gebruikt voor de amplificatie van recombinant bao-virus in suspensie, moeten een dichtheid hebben van 1,4 keer 10 tot de zes cellen per milliliter en de kweek moet een twintigste van het totale kolfvolume beslaan. Bijvoorbeeld, 50 milliliter in een tweeduizendliterkolf. Over het algemeen voor optimale vao-virusamplificatie en eiwitproductie, moeten de SF negen-cellen uniform in grootte en sferisch zijn.

Besmette de SF negen-celkweek met de P een-virale stock bij een multiplicitie van infectie of MOI van 0,1 met behulp van de volgende formule. Incubeer de P een geïnfecteerde insectenkweek bij 27 graden Celsius met schudden bij 100 RPM gedurende 72 uur. Drie dagen later, oogst het virus door de cellen van het medium te scheiden door centrifugatie bij 1000 Gs gedurende vijf minuten.

Bij kamertemperatuur brengt u het verdunde virus-verrijkte medium over in een schone buis. Deze virale stock wordt aangeduid als P twee en de verwachte virale titer is twee keer 10 tot de acht PFU per milliliter. Bewaar deze virale stock bij vier graden Celsius in het donker tot gebruik, bewaar de resulterende cellenpellets bij negatief 20 graden Celsius voor latere bevestiging van recombinante virusproductie.

Om deze procedure te beginnen, kweekt u een voldoende volume SF negen-celculturen in suspensie en SF 902 s fm. Aangevuld met 100 microgram per milliliter penicilline en 100 microgram per milliliter streptomycine. De verhouding tussen het totale kweekvolume en het kolfvolume moet één op vijf zijn.

Incubeer de suspensiekweek bij 27 graden Celsius met schudden bij 100 RPM totdat ze een celdichtheid van twee keer 10 tot de zes cellen per milliliter bereiken. Wanneer de SF negen-culturen een dichtheid hebben van twee