Single Eicel bisulfiet Mutagenese

Het algemene doel van deze procedure is om de DNA-methylering in een enkele oocyten te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst cumuluscellen en soap palita uit de verzamelde oocyten te verwijderen. De tweede stap is om de oocyt in een lysisoplossing in een verhouding van twee op één in te bedden om te voorkomen dat de minieme hoeveelheid DNA verloren gaat of degradeert.

Vervolgens wordt bisulfiet-mutagenese uitgevoerd, gevolgd door amplificatie via een nested polymerasekettingreactie. De laatste stap is het ligeren en klonen van het PCR-product. De klonen worden vervolgens geselecteerd, via PCR geamplificeerd en ter sequencing verzonden.

Uiteindelijk wordt bisulfietmutagenese en sequencing gebruikt om DNA-methylering aan cytosine-fosfaat-guanine, of CpG-dinucleotiden, van een regio van belang in een enkele oocyte aan te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals bisulfietmutagenese van grote celaantallen, is dat gegevens kunnen worden verkregen uit één enkele oocyte zonder het samenvoegen van cellen, PCR-bias en contaminatie door somatische cellen. Bereid op de dag van de oocytecollectie de oplossingen voor die in het geschreven protocol worden vermeld; verminder bij het maken van de oplossingen de kans op DNA-contaminatie door vaak de handschoenen te wisselen en filtertips te gebruiken, en houd buisjes schuin weg wanneer ze openstaan en sluit alle buisjes af wanneer ze niet in gebruik zijn.

Begin de OSI-collectie door de gedissecteerde oviducten van de muis in M2-medium te plaatsen en aan de M-pulley te trekken om het cumuluscelcomplex te extraheren. Scheid vervolgens de oocyten van het cumuluscelcomplex met behulp van een hyaluronidase-oplossing van 0,3 mg/mL in een druppel van 30 µL M2-medium. Houd de oocyten slechts zo lang mogelijk in de oplossing als nodig is om de cumuluscellen te verwijderen, aangezien langdurige blootstelling ze kan beschadigen.

Was de oocyten in druppels van 30 µL M twee medium door de oocyten van druppel naar druppel over te brengen. Verwijder periodiek de cumuluscellen voor een totaal van drie wasbeurten. Verwijder de Z van LUCITA met behulp van een zure tyro-oplossing.

Plaats de oocyten eerst in één druppel van 30 µL van de oplossing en breng ze vervolgens over naar een andere druppel van 30 µL. Elk meegelopen medium zal het zuur namelijk verdunnen en de efficiëntie verminderen. Houd de cellen slechts zo kort mogelijk in de oplossing om de zona te verwijderen, aangezien langdurige blootstelling ze kan beschadigen.

Na het verwijderen van de zona worden de cyten opnieuw gewassen in een druppel van 30 µL M2-medium om vervolgens Agarose-embedding uit te voeren. Plaats eerst de lysisoplossing op een warmteblok van 70 °C. Voeg de voorverwarmde laag-smeltende agarose (LMP Agarose) toe aan de lysisoplossing, zodat een verhouding van twee op één tussen de Agarose en de lysisoplossing ontstaat. Plaats vervolgens een enkele oöcyt in een minimale hoeveelheid M2-medium op een schoon glazen objectglas.

De volgende stap is om de enkele cel in de Agros- en lysisoplossing in te bedden. Dit moet snel gebeuren, aangezien de agros stolt bij temperaturen onder de 65 °C. Neem onder een microscoop 10 µL van de Agros-lysisoplossing op met een pipetpunt.

Breng voorzichtig ongeveer 1 µL of minder van de agros lysiselectie aan op de glazen plaat, zodat het mengt met het minimale medium. Neem de oocyten voorzichtig op in de pipetpunt. Breng vervolgens alle 10 µL over in een einor-buisje met 300 µL minerale olie, zodat de resulterende druppel een bolvorm aanneemt.

Incubeer de buis 10 minuten op ijs voor de lyse. Verwijder de 300 µL minerale olie en voeg 500 µL van de SDS-lysebuffer toe. Incubeer het monster de volgende dag gedurende de hele nacht in een waterbad ingesteld op 50 °C.

Bereid de bisulfiet-mutagenese-oplossingen vers zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Begin de mutagenese door de 500 µL SDS-lysebuffer volledig te verwijderen. Houd er rekening mee dat elke resterende lysebuffer de agarose zal verdunnen wanneer deze wordt verhit, waardoor de kraal in de volgende stappen gevoeliger wordt voor oplossen.

Nadat de lysisbuffer volledig is verwijderd, worden 300 µL minerale olie toegevoegd. Incubeer het monster gedurende twee en een halve minuut op een warmteblok van 90 °C. Vermijd het mengen, roeren of laten fluctueren van de temperatuur.

Na twee en een halve minuut. Incubeer het monster 10 minuten op ijs. Om de denaturatie uit te voeren, verwijdert u de minerale olie en voegt u één milliliter 0,1 molar natriumhydroxide toe aan de buis; tik tegen de buis en keer deze vijf tot zes keer om.

Incubeer het monster gedurende 15 minuten in een waterbad ingesteld op 37 °C, waarbij elke drie tot vier minuten wordt omgekeerd; de kraal moet in het natriumhydroxide drijven. Let op dat de kraal zich niet langer onderin de buis bevindt.

Om de sulfietbehandeling uit te voeren, wordt de buis eerst voorzichtig gecentrifugeerd nadat het natriumhydroxide is verwijderd. Voeg 300 µL minerale olie en 500 µL BIS-sulfietoplossing toe. Zorg dat er geen blootstelling aan licht plaatsvindt en incubeer de buis gedurende drie en een half uur in een waterbad van 50 °C.

Voer nu de denaturatie uit. Incubeer het monster eerst drie minuten op ijs voordat de minerale olie en de BIS-sulfietoplossing worden verwijderd. Voeg na een korte centrifugatie één milliliter 0,3 M natriumhydroxide toe en tik en keer de buis vijf tot zes keer om.

Incubeer het monster 15 minuten lang. In een waterbad van 37 °C, waarbij elke drie tot vier minuten wordt omgekeerd; nogmaals, de kraal moet in het natriumhydroxide drijven voordat de PCR wordt gestart. Was de monsters door ze eerst voorzichtig te centrifugeren.

Verwijder vervolgens het natriumhydroxide en voeg één milliliter van één xte pH 7,5 toe. Schud gedurende vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur. Na een tweede korte centrifugatie wordt de one XTE verwijderd.

Herhaal dit wasproces tweemaal. Voeg vervolgens één milliliter autoclaveer-dubbelgedestilleerd water toe. Schud gedurende vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur, centrifugeer voorzichtig voor een derde maal en verwijder het water.

Herhaal het wassen met dubbel gedestilleerd water tweemaal. Verwijder tot slot al het supernatant, zodat alleen de aros-kraal overblijft. Controleer of de pH van het supernatant 5,0 is.

Als het supernatant nog te basisch is, was de beads dan opnieuw met dubbel gedestilleerd water. Voeg ondertussen de PCR-mix voor de eerste ronde toe aan de PCR-buis, zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Schuif de solid agro naar de rand van de einor-buis.

Breng vervolgens de agro speed voorzichtig over naar de PCR-buis, verhit deze één minuut lang tot 70 °C, meng en amplificeer zoals gesuggereerd in het schriftelijke protocol. Bereid na de eerste amplificatieronde de tweede PCR-reactieronde voor met vijf µL van het product uit de eerste ronde als template. Zorg ervoor dat u pipetteert onder de laag minerale olie.

Voer de tweede ronde van amplificatie uit zoals beschreven in de tekst voor een diagnostische test. De monsters van de tweede ronde kunnen worden geknipt met een restrictie-enzym dat methylerings- of stamspecifiek is; voer elektroforese uit van de digestieproducten op een 8% acrylamidegel. Eventuele heterogene banden die ontstaan, vertegenwoordigen meer dan één sequentie. Om het product van de tweede ronde te kloneren, wordt dit in de vector geligeerd en wordt TA-klonering uitgevoerd zoals beschreven in het manuscript dat bij deze video hoort. Na de TA-klonering wordt het gehele reactiemengsel op een LB-agarplaat geplaatst, aangevuld met ampicilline, X-gal en IPTG, waarna de plaat gedurende één nacht bij 37 °C wordt geïncubeerd.

Voeg vervolgens de colony PCR-mastermix toe aan de PCR-buis zoals beschreven in het geschreven protocol. Pak met een pipetpunt een witte bacteriële kolonie van de plaat en meng deze door middel van swirling in 35 µL van de colony PCR-mastermix in een PCR-buis. Ga verder met het amplificeren van de suspensie zoals beschreven in de tekst na de PCR-amplificatie; voer vervolgens een elektroforese uit met 4 µL van het PCR-product op een 1,5% AGROS-gel.

Stuur tenslotte ongeveer 30 µL van het PCR-product ter sequenering van vijf kolonie-PCR's per cyte. Zodra de sequeneringsresultaten bekend zijn, kunnen de methyleringspatronen worden afgelezen; elke oorspronkelijke cytosine-guanine die ongewijzigd is gebleven, was gemethyleerd. Omgekeerd was elke oorspronkelijke cytosine-guanine die nu een thymine-guanine is, niet gemethyleerd na nested PCR-amplificatie met gebruik van bisulfit-geconverteerde primers.

Het is mogelijk om een succesvolle conversie te bevestigen door de juiste fragmentgrootte te visualiseren op een agarosegel van een individuele metafase. Twee oocyten vertegenwoordigen één ouderlijk allel en hebben in theorie één geïmprint methyleringspatroon. PCR-producten uit de tweede ronde kunnen worden getest op onbedoelde contaminatie.

Een restrictie-enzym dat gevoelig is voor DNA-methylering kan worden gebruikt om het product van de tweede PCR-ronde te digesteren om vast te stellen of het een gemethyleerd of ongemethyleerd allel bevat. Hierbij wordt een gemethyleerd cytosine binnen de herkenningssequentie van het enzym gesplitst. Terwijl een ongemethyleerd cytosine dat is omgezet in thymine niet langer door het enzym wordt herkend en ongesneden blijft, moet elk monster van een oocyten in metafase twee dat zowel gemethyleerde als ongemethyleerde allelen bevat, worden weggegooid, aangezien dit duidt op contaminatie door cumuluscellen of de aanwezigheid van een pollichaam na ligatie en transformatie.

Een succesvolle colony PCR-amplificatie kan worden gevisualiseerd op een agarosegel om te garanderen dat monsters met de juiste productgrootte voor sequencing worden verzonden. Voor dit voorbeeld is de verwachte amplicongrootte na ligatie 56 basenparen. Hier heeft kloon vijf een onjuiste amplicongrootte en mag deze niet voor sequencing worden verzonden.

De sequentie van vijf individuele klonen uit een oöcyt in metafase II zou vijf identieke methyleringspatronen en identieke niet-CpG-conversiesnelheden moeten produceren. Alle monsters die meer dan één patroon bevatten, moeten worden weggegooid. Aangezien ovulaties oöcyten in metafase II twee chromosoomkopieën of een aangehecht pollichaam hebben, bestaat de mogelijkheid dat er twee soortgelijke sequentiepatronen worden verkregen.

Gegevens moeten worden verworpen van alle cellen die sterk afwijkende methyleringspatronen vertonen. Aangezien contaminatie door cumuluscellen bij deze procedure niet kan worden uitgesloten, is het belangrijk om eerst de oocyten meerdere malen te wassen in vers medium na de HI IDE-behandeling, om zoveel mogelijk cumuluscellen te verwijderen. Ten tweede zal de laagsmeltende agarose stollen bij temperaturen onder 65 °C, dus werk zorgvuldig maar snel.

En tot slot zijn natriumbisulfaat en hydrochinon lichtgevoelig, dus reactiebuizen en oplossingen moeten in folie worden gewikkeld.