Optische registratie van suprathreshold neurale activiteit met single-cell en single-spike resolutie

Het algemene doel van het FollowMe-experiment is om neurale spiking-activiteit van een groot aantal neuronen vast te leggen. Dit wordt in de eerste stap bereikt door met fluorescentiemicroscopie de toename van de intracellulaire calciumconcentratie in een neuronen-soma te observeren, die geassocieerd is met elk actiepotentiaal. Twee-foton excitatie en een random access scanning-principe worden gebruikt om calciumfluorescentiesignalen van 40 neuronen-soma's vast te leggen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

In de tweede stap worden de precieze timingen van de spikes geëxtraheerd uit de fluorescentiesignalen met behulp van een deconvolutie-algoritme. Deze techniek kan worden gebruikt om de spiking-activiteit van tientallen neuronen vast te leggen. De spiking-gegevens kunnen vervolgens worden gebruikt om onderlinge informatie, signaalvoortplanting tussen neuronale populaties of neuronale correlaties te meten.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals registraties met micro-elektroden, is dat de spiking-activiteit van een groot aantal neuronen uit een lokale populatie kan worden geregistreerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de corticale functie op het niveau van lokale neuronale netwerken, zoals het belang van correlaties bij het zoeken naar informatie en veranderingen in de netwerkdynamiek bij corticale plasticiteit. Voor tweefoton-excitatie wordt een infrarood pulslasersysteem met femtoseconde-pulsen gebruikt. Een hoog laseruitgangsvermogen is vereist om de grote verliezen te compenseren die worden veroorzaakt door de optische componenten van het systeem.

Een precompensatiesysteem bestaande uit twee prisma's brengt een negatieve groepssnelheidsdispersie aan op de laserpulsen vóór de optische deflectoren om de temporele dispersie te compenseren die door de AOD's wordt geïntroduceerd. Twee AOD's met grote aperturen deflecteren de laserstraal in twee dimensies. Een reflecterend diffractierooster met 100 groeven per millimeter is 13 centimeter achter de AOD's geplaatst om de ruimtelijke dispersie te compenseren die door de AOD's wordt geïntroduceerd. Bij het gebruik van korte laserpulsen wordt de laserstraal via twee relaistelescopen naar de cameraport van een rechtopstaande microscoop geleid.

Irissen zijn op regelmatige afstanden geplaatst voor de uitlijning van de optische componenten. Een dichroïsche beamsplitter voor de objectief laat het infrarode excitatielicht door naar het preparaat en reflecteert het fluorescentielicht van het preparaat naar een detector. Epi- en transfluorescentiedetectoren vangen het fluorescentiesignaal op via het objectief, waarbij gekleurde glasfilters in de condensor voor de detectoren zijn geplaatst om te voorkomen dat excitatielicht de detectoren bereikt.

De afbuigingshoeken van A OD worden aangestuurd door een computer die is uitgerust met een digitaal-analoge converterkaart, die op zijn beurt spanningsgestuurde oscillatoren aanstuurt. Het signaal van de fotovermenigvuldigers wordt doorgegeven via een laagdoorlaat Butterworth-filter met een afsnijfrequentie van 100 kilohertz en wordt gedigitaliseerd door een analoog-digitaal converter met een kloksnelheid van 156,25 kilohertz voordat het op een computer wordt opgeslagen voor analyse; uitlijning en elektrische ruis worden getest door de verdeling van fluorescentiesignalen op te nemen met en zonder laserlicht bij een lage en hoge versterking van de fotovermenigvuldigers, alsmede met en zonder indicator. Dithered random access scanning is gebaseerd op de detectie van intracellulaire calciumstijgingen. De eerste stap in het protocol is het kleuren van een groot aantal neuronen met de estervorm van een calciumindicator via bolusinjectie.

Registreer vervolgens de activiteit van het soma bij elk neuron op vier locaties gedurende 6,4 microseconden per locatie. Om de gewenste neuronen te selecteren, wordt er een volledig frame van 256 bij 256 pixels vastgelegd. Selecteer daarna handmatig de centra van de neuronen die in dit beeld moeten worden geregistreerd.

In elke cyclus worden door de aansturingssoftware automatisch drie punten op een afstand van twee micron rond elk centrum toegevoegd. Het fluorescentiesignaal wordt geregistreerd vanaf de vier locaties in alle 40 neuronen. De registratie van alle neuronen in één cyclus vereist 1,536 milliseconden.

Herhaal deze sequentiële opname van alle 40 neuronen gedurende vijf seconden. Spike-detectie op basis van fluorescente somatische calciumsignalen is afhankelijk van een hoge signaal-ruisverhouding. Een hoge signaal-ruisverhouding kan worden bereikt door de excitatie-intensiteit te verhogen.

De excitatie-intensiteit kan echter slechts tot een bepaalde limiet worden verhoogd vanwege fotobeschadiging. Er is slechts een zeer klein venster van excitatie-intensiteit waarbij de fotobeschadiging gering is en de signaal-ruisverhouding voldoende is om individuele spikes te detecteren, om zo te waarborgen dat de geregistreerde signalen binnen het venster voor een hoge spikedetectie vallen. Tijdens een experiment wordt gebruikgemaakt van een aantal online analyse-softwareprogramma's die door ons laboratorium zijn ontwikkeld.

Bereken vervolgens de geschatte fotonensnelheid per neuron over een kort tijdsinterval van basislijnruis van ongeveer 100 tot 200 milliseconden. Het aantal fotonen en de fotonensnelheid worden berekend uit de fluorescentiewaarden door de distributie van relatieve fluorescentieveranderingen met deze vergelijking te fitten; bereken vervolgens de basislijnfluorescentie over hetzelfde tijdsinterval en zet deze uit als functie van de tijd of de trials. Houd de gemiddelde afname van de basislijn onder de 0,0002 per seconde door het laservermogen aan te passen.

Omdat de detectie van spikes snel afneemt wanneer deze limiet wordt overschreden. Verifieer daarna elke 10 tot 20 minuten de posities van de neuronale soma door een volledig frame-beeld op te nemen. Pas de registratielocaties aan indien nodig.

De fluorescerende signalen die voortkomen uit neurale activiteit lopen vaak in de tijd achter vanwege de lange afname van de calciumtransiënten. In deze procedure wordt een deconvolutiemethode gebruikt om spikes en de timing van spikes uit de fluorescerende signalen af te leiden. Hier gebruiken we een genetisch algoritme om het meest waarschijnlijke model van de spike-trein te bepalen dat past bij het geregistreerde fluorescerende signaal.

Bij elke iteratie van het algoritme nadert de maximum likelihood asymptotisch het maximum dat wordt bepaald door de ruis van de fluorescentieopnames. In inhomogene populaties neuronen kan het door actiepotentialen opgewekte calciumsignaal variëren tussen neuronen. Voor ongesuperviseerde analyse van grote datasets hebben we een algoritme ontworpen dat rekening houdt met de variatie van het door actiepotentialen opgewekte calciumsignaal van neuron tot neuron om een groot aantal fout-positieve detecties te voorkomen.

De gezamenlijke verdeling van de amplitude en de tijdconstante van het verval van calciumtransiënten opgewekt door enkele spikes is vastgelegd in een aparte reeks experimenten met hetzelfde type neuronen onder dezelfde experimentele omstandigheden. Om rekening te houden met langzame baseline-veranderingen en om de computationele kosten van de deconvolutie te verlagen, worden langere opnames voor elk neuron in elke opname verdeeld in verschillende kortere traces van één tot vijf seconden. Het deconvolutie-algoritme kan een groot aantal modellen testen, tot wel 1 miljoen verschillende modellen of meer; om de deconvolutie te versnellen, wordt één experiment parallel op maximaal 10 verschillende computers gedeconvolueerd.

Na deconvolution worden de spike-gegevens geanalyseerd en geïnspecteerd. De spike-waarschijnlijkheid van het peri-stimulus tijdshistogram en de vuursnelheid van het neuron worden op geautomatiseerde wijze berekend. Hier zijn voorbeelden van een fluorescentiesignaal geregistreerd bij een zeer lage excitatiegraad en een ander bij een zeer hoge excitatiegraad binnen het detectievenster.

Let op dat elk voorbeeld de respons op één spike laat zien. Hier wordt een fotomicrograaf van een acute hersensnijde getoond, samen met twee stimulatiepipetten die in dezelfde corticale kolom zijn geplaatst. In laag vier worden de neurale responsen voor de repetitieve stimuli getoond, en deze grafiek geeft de onderlinge informatie van Shannon weer, gesignaleerd door de geregistreerde populatie neuronen.

Hier is de meting van de voortplanting van superdrempelige spiking-activiteit tussen verschillende populaties corticale neuronen. Dit zijn de gedetecteerde spikes in corticale neuronen als reactie op elektrische stimulatie van thalame corticale vezels. Bij het registreren van neuronale activiteit met behulp van random access scanning is het zeer belangrijk om binnen het detectievenster te registreren.

Anders is de kans groot dat men eindigt met onbruikbare datasets. Optische spike-detectie staat nog in de kinderschoenen. Er is nog veel ruimte voor verbetering.

Met enkele verbeteringen kunnen we vanuit nog meer neuronen registreren. Met andere verbeteringen zullen we zelfs in staat zijn om registraties uit te voeren bij wakker wordende en bewegende dieren.