Single Cell Meting van dopamine-afgifte met gelijktijdige Voltage-klem en amperometrie
21 november 2012
De amperometrische techniek meet dopamine afgifte van een enkele cel door het detecteren van de stroom die door oxidatieve spontane dopamine oxidatie. Gelijktijdig spanning klem en amperometrie methodologie onthullen de mechanistische relatie tussen de totale "activiteit" van dopamine transporter en de regulerende rol van deze activiteit op de achterzijde transport van dopamine.
Het doel van deze procedure is om het omgekeerde transport van dopamine te meten in een neuron dat spanningsgeclamp is, waarbij gelijktijdige patchclamp en pyrometrie worden gebruikt om de DAT-gemedieerde dopaminevrijgave te meten. Dit wordt bereikt door eerst de integriteit van de pyrometrische elektrode met dopamine te testen. De tweede stap is om de pyrometrische elektrode nabij de cel te plaatsen en een whole-cell patch van het neuron te realiseren met een patchpipet.
Vervolgens wordt de spanning van de cel geregeld met de patchpipet, terwijl de door DAT gemedieerde dopamineafgifte van de cel gelijktijdig wordt geregistreerd met een pyrometrische elektrode. De laatste stap is het toevoegen van de DAT-blokker en het opnieuw registreren van de whole-cell- en pyrometrie-stromen, zodat de specifiek door de dopaminetransporteur gemedieerde stroom kan worden afgetrokken. Het belang van deze techniek is de mogelijkheid om het omgekeerde transport van dopamine via de dopaminetransporteur te meten, terwijl de spanning van het dopaminerge neuron gelijktijdig wordt gecontroleerd.
Het systeem voor gelijktijdige patchclamp- en barometrie-registratie vereist een omgekeerde microscoop met uitstekende DIC-optiek en een objectief met een grote werkafstand om een DC-lichtbron voor het systeem te genereren. Sluit de microscoopverlichting bij een laag elektrisch ruisniveau aan op een autobatterij. De hydraulische micromanipulatoren worden gebruikt omdat ze in onze configuratie niet wezenlijk bijdragen aan de ruisniveaus.
Een rechtshandige manipulator wordt gebruikt voor de voltage clamp, whole-cell registratie en de linkerhandige manipulator voor de pyrometrie. Om de elektrode voor whole-cell registratie voor te bereiden, wordt een kwartspipet uitgetrokken met een P 2000 puller. Normaal gesproken gebruiken we een pipet met een weerstand van drie tot vier mega ohm.
Vul vervolgens de elektrode met de pipetoplossing die 1 mM dopamine bevat. Monteer deze daarna op de pipethouder van de rechtermanipulator. Zorg ervoor dat de container met de dopamine-bevattende pipetoplossing wordt omwikkeld met aluminiumfolie en op ijs wordt bewaard wanneer deze niet in gebruik is.
Aangezien dopamine oxideerbaar is, zal het op ijs bewaren van de oplossing en het beschermen tegen licht de oxidatiesnelheid verlagen. Steek de zilverdraad in de elektrodehouder en draai vervolgens de am parametrische adapter op de elektrodehouder. Vul daarna de tric-elektrode met voldoende kwik om contact met de zilverdraad te maken.
Wanneer de elektrode op de adapter wordt gemonteerd, dient de pro CFE low noise koolstofvezel- en parametrische elektrode onder de microscoop te worden geïnspecteerd om te controleren of de tip schoon en intact is. Houd het uiteinde van de koolstofvezel vast om beschadiging van de tip van de koolstofvezel te voorkomen. Monteer vervolgens de pro CFE Tric-elektrode.
Monteer vervolgens de geassembleerde elektrode op de linker hydraulische manipulator om de integriteit van de tric-elektrode te controleren. Laat deze zakken in een Petri-schaal met glazen bodem die de externe oplossing bevat. Registreer de basisstroom in afwezigheid van dopamine.
Voeg vervolgens 10 µL van een 1 mM dopamine-oplossing toe aan de schaal. Een goede amperometrische elektrode zou een toename van de oxidatiestroom moeten registreren. Controleer de integriteit van de amperometrische elektrode vóór en na de experimenten.
Haal bij deze procedure de dopaminerge neuronen of cellen die zijn gemodificeerd om dopaminetransporteurs tot expressie te brengen, vanuit de incubator en de glazen bodem-Petrischaal waarin ze zich bevinden. Was de cellen of dopaminerge neuronen voorzichtig drie keer met een warme externe oplossing. Om de cellen te visualiseren en het experiment uit te voeren, plaatst u de glazen bodem-Petrischaal op de microscooptafel en bepaalt u het juiste brandpunt om de cellen duidelijk in beeld te brengen.
Breng vervolgens positieve druk aan op de patch-elektrode. Gebruik een spuit van één milliliter om beide elektroden voorzichtig in de oplossing en dichter bij de cel te brengen met behulp van de micromanipulatoren. Positioneer daarna de emper metric-elektrode aan de linkerkant van de cel en de patch-elektrode aan de rechterkant.
Wanneer de patchelektrode de cel raakt, wordt er met de mond of een spuit lichte zuigkracht uitgeoefend om een giga-seal op de cel te vormen. Verbreek daarna de seal met zuigkracht om de whole-cell configuratie te bereiken, en laat de dopaminebevattende interne oplossing vijf tot acht minuten dialyseren in de cel.
Registreer vervolgens de door DAT gemedieerde stromen door de membraanspanning van de cel via de pipet te variëren tussen minus 60 en plus 100 millivolt, vanuit een rustpotentiaal van minus 40 millivolt. Om de specifieke door DAT gemedieerde dopamineflux te bepalen, worden de empirische stromen geregistreerd in afwezigheid en aanwezigheid van een DAT-antagonist. De specifieke door DAT gemedieerde stroom wordt vervolgens bepaald door de sporen die zijn opgenomen in aanwezigheid van de DAT-antagonist af te trekken van de empirische sporen die zonder de antagonist zijn opgenomen.
Een opwaartse afbuiging in de tric-stromen komt overeen met een uitwaartse flux van dopamine, zoals hier getoond. DAT-gemedieerde stromen werden geregistreerd door de membraanspanning in stappen van 20 millivolt te variëren tussen minus 60 en plus 100 millivolt, vanuit een rustpotentiaal van minus vier C millivolt, met een pipet die twee millimol dopamine bevat in de whole-cell patching-modus. Hier is de empermetrische stroom die gelijktijdig met de whole-cell stroom is verkregen.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de reverse transport van dopamine via de dopaminetransporteur in een voltage-geclampte neuron gemeten kan worden. Denk eraan om de integriteit van de parametrische elektrode voor en na de experimenten te controleren, en vergeet niet de traces die zijn opgenomen in aanwezigheid van die antagonist af te trekken van de traces die zonder de antagonist zijn opgenomen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een techniek om het omgekeerde transport van dopamine in neuronen te meten met behulp van gelijktijdige patchclamp en pyrometrie. De methode maakt het mogelijk om de door de dopaminetransporter (DAT) gemedieerde afgifte te beoordelen terwijl de spanning van het neuron wordt gecontroleerd.
Belangrijkste Onderzoeksonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Neurotransmitterdynamiek
Achtergrond
- Dopamine is een cruciale neurotransmitter die betrokken is bij diverse hersenfuncties.
- De dopaminetransporter speelt een sleutelrol bij de regulatie van dopamineniveaus.
- Inzicht in mechanismen van revers transport is essentieel voor het begrip van dopaminerge signalering.
- Deze techniek combineert voltageclamping met amperometrische metingen voor een verbeterde nauwkeurigheid.
Doel van de studie
- Om het revers transport van dopamine in voltage-clamped neuronen te meten.
- Om de relatie tussen DAT-activiteit en dopamine-afgifte te onderzoeken.
- Om een methode te bieden voor het bestuderen van de functie van dopaminerge neuronen in real-time.
Gebruikte Methoden
- Het testen van de integriteit van de pyrometrische elektrode met dopamine.
- Het verkrijgen van een whole-cell patch van het neuron met behulp van een patchpipet.
- Het beheersen van de celspanning met de patchpipet.
- Het registreren van DAT-gemedieerde dopaminevrijgave met de pyrometrische elektrode.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van dopaminevrijgave tijdens voltage clamping.
- Het effect van DAT-blokkers op dopaminetransport is aangetoond.
- Inzichten verschaft in de reguleringsmechanismen van dopaminetransport.
- De methode voor het bestuderen van neuronale dopaminedynamiek is gevalideerd.
Conclusies
- De techniek meet effectief het revers transport van dopamine.
- Simultane controle van de spanning verbetert het begrip van de DAT-functie.
- Deze methode kan worden toegepast in verdere studies naar dopaminerge signalering.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Deze methode maakt directe meting van dopamine-efflux via de dopaminetransporter onder spanningscontrole mogelijk, wat mechanistisch inzicht biedt in de transporterfunctie die relevant is voor de ontdekking van neuropsychiatrische geneesmiddelen. Door DAT-gemedieerde afgifte in realtime te isoleren, ondersteunt het de target-validatie en vermindert het de risico's van hypothesen over dopaminerge signalering in ziektemodellen. De aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door transporteractiviteit te koppelen aan neurotransmitterdynamiek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt het effluxmechanisme van de dopaminetransporter om functionele target-engagement in levende neuronen te valideren.
- Operationele waarde: Maakt gelijktijdige elektrofysiologische en amperometrische registratie mogelijk om het membraanpotentieel te correleren met de transporter-gemedieerde dopamineflux.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, tijdopgeloste oxidatieve stroommetingen die de DAT-afhankelijke dopamineafgifte weerspiegelen onder gecontroleerde voltagesprongen.
- Operationele waarde: Vestigt een reproduceerbaar assay-formaat voor het meten van transporter-gemedieerde efflux, wat screening van verbindingen voor DAT-modulatoren ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt de DAT-effluxactiviteit aan de extracellulaire dopamine-homeostase, wat nuttige informatie verschaft voor ziektemodellen waarbij transporterdisfunctie een rol speelt.
- Operationele waarde: Biedt een ziekterelevant systeem om genetische of farmacologische verstoringen van de dopamine-transporterfunctie te beoordelen.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode past binnen workflows voor vroege ontdekking door mechanische risicoreductie van dopaminetransporteur-doelwitten mogelijk te maken voorafgaand aan inspanningen voor lead-identificatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen van mechanismen voor transporter-reversie en verduidelijking van signaalpaden in dopaminerge neuronen.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve outputs voor het evalueren van de effecten van verbindingen op DAT-gemedieerde efflux.
- Analytics: Maakt gelijktijdige whole-cell stroommetingen en amperometrische metingen mogelijk om DAT-specifieke signalen te isoleren via farmacologische subtractie.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinische continuïteit door dopamine-dysregulatie te modelleren in spanningsgestuurde neuronale systemen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het beoordelen van transporterfuncties in meerdere neuronale modellen of ziektecontexten.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door de efflux-gemedieerde dopaminevrijgave direct te meten onder fysiologische spanningscontrole.
- Operationele waarde: Bevordert de standaardisatie van assays door gesynchroniseerde patchclamp en amperometrie, waardoor de variabiliteit in metingen van de neurotransmitterflux wordt verminderd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door het werkingsmechanisme van de transporter te verduidelijken, wat uitval in een laat stadium door mechanische misinterpretaties vermindert.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van DAT-gerichte verbindingen mogelijk op basis van functionele gegevens over efflux-modulatie.
Overwegingen bij implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie, amperometrie en neuronale kweek om de integriteit van de elektroden en de getrouwheid van het signaal te waarborgen.
- Is afhankelijk van instrumenten met een laag ruisniveau, waaronder hydraulische manipulatoren, dubbele Axopatch 200B-versterkers en koolstofvezelelektroden voor gelijktijdige registratie.
- Noodzaakt standaardisatie tussen teams van spanningsprotocollen en methoden voor antagonist-subtractie om de vergelijkbaarheid tussen experimenten te garanderen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan verschillende neuronale modellen, in het bijzonder met betrekking tot de expressieniveaus van dopaminetransporteurs en de membraangezondheid.
- Bevat praktische beperkingen zoals de oxidatie van de dopamine-oplossing, wat beschermende behandeling en baseline-validatie voor en na de experimenten vereist.
