Microdialyse van alcohol tijdens de operante ethanol zelftoediening en ethanol bepaling door gaschromatografie

Het algemene doel van deze procedure is het monitoren van de ethanolspiegels in het dialysaat van de hersenen tijdens een sessie van ethanol-zelftoediening. Om deze meting te kunnen vergelijken met synchrone zelftoedieningsgedragingen, wordt dit bereikt door eerst chirurgisch een microdialysegeleider, canule en bevestigingsbout te implanteren, en vervolgens ratten te trainen om operant ethanol zelf toe te dienen. De tweede stap is om de ratten te laten wennen aan de tether van de head stage, zodat deze de ethanol-zelftoediening tijdens de microdialyse niet belemmert.

Vervolgens wordt microdialyse uitgevoerd tijdens een sessie van zelfadministratie van ethanol, waarbij een deel van het dialysaat wordt klaargemaakt voor ethanolanalyse. Daarna worden de dialysaatmonsters geanalyseerd op de ethanolconcentratie met behulp van een gaschromatograaf met vlamionisatiedetectie. Uiteindelijk laten de verkregen resultaten het verloop zien van de tijd waarin ethanol de betreffende hersenregio bereikt tijdens een sessie van zelfadministratie van ethanol.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals punctie van de staart- of vena saphena, is dat deze procedure minimaal belastend is tijdens de monstername en het mogelijk maakt om de drugconcentratie in de hersenregio van belang in de loop van de tijd te meten terwijl het dier een gedragstaak uitvoert. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat er een aantal gespecialiseerde vaardigheden vereist zijn, waarvan vele alleen door herhaald oefenen of ervaring kunnen worden verworven. De procedure wordt gedemonstreerd door Jeffrey Dilley, een undergraduate onderzoeksassistent in ons laboratorium.

Alle getoonde dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Texas en volgen alle richtlijnen voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren. De University of Texas at Austin is een ALAC-geaccrediteerde faciliteit; voor deze gedragskundige microdialyse-experimenten worden Long Evans-ratten gebruikt die zorgvuldig zijn behandeld en waarin chirurgisch een 21 gauge canule boven het relevante hersengebied is geïmplanteerd. Alle dieren moeten ten minste één week postchirurgische zorg en herstel hebben ontvangen en gezond zijn voordat aan de volgende procedures wordt begonnen.

Plaats de rat in een operante kamer van Med Associates, uitgerust met een inklapbare Lichter-hendel en een tipperbuis, en train de rat om op de hendel te drukken voor toegang tot een 10% sucrose-oplossing. Nadat de rat is getraind om te reageren op de sucrose-oplossing, wordt gestart met een passend trainingsschema waarbij ethanol geleidelijk aan de oplossing wordt toegevoegd over meerdere drinksessies, de avond voor de voorlaatste operante sessie. Nadat het dier is geanestheseerd en het sedatieniveau is gecontroleerd, wordt de trekveer bevestigd aan de tetherbout op de headstage van de rat om het dier te laten wennen aan de apparatus, bestaande uit een tegenwichthendel, arm, draaibare tether, veer en ringstandaard.

Laat de rat de nacht doorbrengen in de operante kamer in zijn thuiskooi met vrije toegang tot voedsel en water, en voltooi vervolgens de trainingssessie van de volgende dag met de tether en de bijbehorerende apparatuur op hun plaats, één dag voor het microdialyse-experiment. Nadat de rat is geanestheseerd met isofluorine, dient de sedatie te worden gecontroleerd door middel van een teenknijptest, waarna een microdialyseprobe wordt ingebracht die is geperfuseerd met kunstmatig cerebrospinaal vocht. Bevestig de probe op de juiste wijze en stel vervolgens de stroomsnelheid van de probe in op 0,2 µL per minuut.

Plaats de rat in de thuiskooi in de operante kamer om de nacht door te brengen met alle dialyseapparatuur op hun plek en met vrije toegang tot voedsel en water. De dag na het inbrengen van de probe, ten minste twee uur voordat het experiment begint, moet de probe worden ingesteld op de werkstroomsnelheid. Controleer met een Hamilton-spuit of de stroomsnelheid van de probe consistent is en ten minste 90% van de ingestelde stroomsnelheid bedraagt.

Als neurotransmitters in de dialysemonsters worden geëvalueerd, neem dan monsters tijdens alle fasen van het experiment. Begin met het verzamelen van dialysemonsters terwijl het dier zich in zijn thuiskooi bevindt. Bewaar de monsters op een geschikte wijze voor latere analyse.

Plaats de rat voorzichtig in de operante kamer en start het operante programma dat de kamer aanstuurt. Blijf monsters nemen terwijl de rat wacht tot de hendel in de kamer uitschuift, waarbij twee monsters worden genomen voordat de hendel uitschuift. Begin met het verzamelen van een deel van elk dialysaatmonster voor ethanolanalyse door een passende aliquot dialysaat in een glazen vial van twee milliliter te pipetteren en de vial te verzegelen met een luchtdicht septum; pipetteer en verzegel de ethanolmonsters snel.

Aangezien ethanol vluchtig is en het monstervolume klein is, zullen inconsistente of trage monstervoorbereidingen leiden tot onnauwkeurige resultaten. Bewaar het resterende deel voor neurotransmitteranalyse. De drinkperiode van 20 minuten begint nadat het computerprogramma van Med Associates de hendel in de kamer schuift en de rat deze indrukt om toegang te krijgen tot een fles drinkoplossing.

Ga door met het nemen van monsters gedurende de gehele drinkperiode; na afloop van de drinkperiode trekt het computerprogramma de fles uit de kamer terug. Houd het dier aan het einde van het microdialyse-experiment nog 20 minuten in de kamer voor een post-drinkperiode. Verwijder de probe nadat de rat is geanestheseerd.

Indien het dier niet onmiddellijk humaan wordt geëuthanaseerd, plaats dan de obturator terug om de visualisatie van het sondekanaal te waarborgen. Neem de hersenen binnen drie dagen na het experiment af. Analyseer de monsters samen met externe ethanolstandaarden met behulp van een gaschromatograaf met een vlamionisatiedetector, een headspace-autosampler die is verwarmd tot 50 °C en een capillaire kolom met helium als mobiele fase.

Gebruik voor het registreren en analyseren van de chromatogrammen chromatografie-workstationsoftware om het systeem voor te bereiden op de analyse van ethanol. Gebruik een recirculerend waterbad om de plaat van de autosampler te verwarmen en open de lucht- en waterstoftanks. Start vervolgens het opstartprogramma.

Zodra deze gereed is, start een verbranding van 20 minuten om de vezel te decontamineren. Maak standaarden door 238 µL 95% ethanol met water te verdunnen tot een eindvolume van 100 milliliter in een maatkolf van 100 milliliter. Gebruik een seriële verdunning van één-op-één om de standaarden te maken.

Pipetteer de standaarden in glazen vials en sluit deze af op precies dezelfde wijze als de monsters zijn voorbereid. Zorg ervoor dat er een waterblindmonster samen met de standaarden wordt meegenomen. Plaats de standaarden en monsters in het tray van de autosampler en verhit deze totdat het volledige vloeibare aliquot is verdampt.

Maak voor het analyseren van de standaarden en monsters een monsterlijst waarin wordt aangegeven welk monster zich in welke slot van de autosampler bevindt, en vermeld dat elk monster gepuncteerd moet worden. Stuur vervolgens de databestanden naar een geselecteerde map, kies de gewenste methode voor de monsters en start de run. Controleer nadat het systeem alle monsters heeft verwerkt of het programma elke piek correct heeft geïntegreerd.

Zet de piekhoogte uit als functie van elke bekende externe standaard ethanolconcentratie. Gebruik de lineaire functie die door de punten wordt gevormd om de ethanolconcentratie van elk dialysaatmonster te interpoleren.

Deze figuur toont voorbeeldchromatogrammen voor drie concentraties ethanolstandaarden en één voor een dialysaataalmonster van een rat, verzameld aan het einde van de sessie voor zelftoediening van ethanol. Ethanolpieken moeten relatief symmetrisch zijn, consistente retentietijden hebben en een signaal-ruisverhouding groter dan 10 vertonen. Indien niet aan deze criteria wordt voldaan, is onderhoud aan het systeem vereist; kwalitatieve chromatografie en correcte standaarden leveren een lineaire standaardcurve op die wordt gebruikt om de ethanolconcentratie te berekenen van dialysaatmonsters die gedurende de zelftoediening zijn verzameld bij dieren die ethanol zelf toedienen.

De afgeleide ethanolconcentraties in het dialysaat zijn niet gecorrigeerd voor het in vivo herstel van de probe en vormen slechts een fractie van de ethanolconcentratie in het hersenweefsel. Indien kwantitatieve microdialyse van ethanol vereist is, wordt de extractiefractie van ethanol die vanuit de extracellulaire ruimte in de probe diffundeert experimenteel bepaald. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in ongeveer vier tot vijf uur worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd.

Dit zal variëren op basis van de lengte van de gedragssessie. De succesvolle voltooiing van de microdialyse-fase van het experiment hangt sterk af van de kwaliteit van de voorbereidende fasen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om er zeker van te zijn dat uw ratten goed zijn gehanteerd en dat u ze hebben laten wennen aan eventuele afleidende stimuli die tijdens het dialyse-experiment kunnen optreden, zodat het zelfadministratiegedrag van het dier niet wordt beïnvloed.