Identificatie van Olfactorische Vluchtige stoffen met behulp van gaschromatografie-en meergezins-Recordings (GCMR) in de Insect antennaal Lobe

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van biologisch effectieve geurstoffen in complexe geuren via registraties in de hersenen van de hommel. Dit wordt bereikt door eerst gedragsmatig effectieve geuren te verzamelen en vervolgens de gaschromatograaf en de multichannel-registratiesystemen voor het experiment voor te bereiden. De derde stap is het prepareren en dissekeren van de hommelhersenen voor de neurale registraties in de antennale lobus.

Het experiment wordt vervolgens uitgevoerd door de elektroden in een antennelob te plaatsen en de responsen op gepofte vluchtige stoffen te meten door analyse van de neurale activiteit als reactie op complexe geuren en hun individuele bestanddelen. Biologisch actieve geurstoffen verkregen via gaschromatografie kunnen worden geïdentificeerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere technieken zoals G-C-E-A-G is dus de gevoeligheid van de antennelastneuronen en het vermogen om te karakteriseren hoe neuronen in de hersenen reageren op specifieke florale vluchtige stoffen.

Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de gecombineerde elektrofysiologische en chemische analytische stappen moeilijk aan te leren zijn vanwege de registratietechniek voor de elektrofysiologische preparatie en de noodzakelijke stappen voor het verzamelen van vluchtige stoffen uit de headspace. Hoewel deze techniek inzicht kan bieden in de olfactorische verwerking van hommels, kan zij ook worden toegepast op andere systemen, zoals ziektevectoren zoals muggen of kusen, of landbouwingestanten zoals bladluizen of motten. Bereid voor deze procedure een referentie-elektrode voor, bestaande uit tungstendraad op een micromanipulator op een tweede.

De micromanipulator is voorzien van een multikanaalelektrode, zoals een gespiralde draad, tede of silicium multikanaalelektrode, die is verbonden met een voorversterker en een gaschromatograaf met een uitgang op een afgeschermde BNC-tafel. De uitgang van de detector van de GC is gekoppeld aan de versterker en het gegevensacquisitiesysteem, zodat zowel de neurale signalen als de GC-signalen gesynchroniseerd zijn. In dit voorbeeld is het dragergas van de GC helium en wordt een DB five GC-kolom gebruikt.

De GC maakt gebruik van een split-inlaat waarbij de temperatuur is ingesteld op 200 °C en de temperatuur van de vlamionisatiedetector is ingesteld op 230 °C. Nadat de monsters in de GC zijn verhit, wordt het effluent uit de kolom via een glazen Y-connector in een verhouding van één op één gesplitst tussen de vlamionisatiedetector en de B-antenne. In dit voorbeeld wordt de GC gebruikt om vluchtige stoffen toe te dienen die via dynamische absorptie zijn verzameld uit de bloemen van Mimus lewisii, een alpine wilde bloem die inheems is in Californië.

Als alternatief kunnen, in plaats van het gebruik van de gc, enkelvoudige vluchtige verbindingen of mengsels van verbindingen worden toegediend via luchtpulsen. Deze worden afgevuurd via een aparte glazen spuit die een stuk filterpapier bevat waarop de verbindingen zijn aangebracht. De luchtpulsen worden afgeleid van een constante luchtstroom met behulp van een computergestuurde magneetventiel.

Begin de voorbereidingen door ongeveer één centimeter van het uiteinde van een pipetteertip van één milliliter af te knippen. Plaats een hommel in de basis van de pipetteertip en duw deze voorzichtig naar het andere uiteinde van de tip totdat alleen de kop zichtbaar is. Maak met gesmolten tandheelkundige was een mal rondom de zichtbare kop.

De was moet aan de samengestelde ogen hechten om de kop volledig te immobiliseren, maar mag indien nodig de antennes niet raken. Gebruik kleine spelden om de antennes te fixeren. Maak vervolgens met een scherp mesje, zoals een microscalpel, een vierkante, vensterachtige incisie in het kopkapsel.

Begin met snijden direct achter de antenne en naast een van de samengestelde ogen. Snijd een rechte lijn tussen de ogen. Snijd vervolgens dorsaal totdat het kopcapsule buigt naar de thorax.

Zet de snede voort tot aan het tegenovergestelde uiteinde van de kopcapsule. Snijd tot slot terug naar het beginpunt om het vierkant te voltooien. Gebruik een pincet om de cuticula te verwijderen.

De cuticula naast de antenne moet worden verwijderd, anders zal deze de elektrode belemmeren zodra de hersenen zijn blootgesteld. Spoel het weefsel onmiddellijk door met insectenzoutoplossing. Zorg ervoor dat de antennelobben goed zichtbaar zijn.

Gebruik vervolgens voorzichtig een zeer fijne pincet om de perineurale schede direct boven de antennelobben te verwijderen. Wees zeer voorzichtig om het brein van de bij niet met de pincet te doorboren. De bij-preparatie is nu klaar voor elektrofysiologische registratie.

Begin met het bevestigen van de voorbereide bij aan een klem die is gefixeerd op een magnetische voet. Houd de bij supersfuseer door middel van insectenzoutoplossing die vanuit een reservoir met een debietregelaar wordt toegediend. Plaats nu de referentie-elektrode in het contralaterale hersenweefsel.

Plaats vervolgens de multichannel-elektrode in de antennelobben van de bij. Wanneer de elektroden op hun plaats zitten, wacht u 30 tot 60 minuten tot de registraties gestabiliseerd zijn.

Bereid gedurende deze tijd de extracellulaire spikes van neuronen voor door middel van drempelwaarde-instelling. Voor sommige opnamekanalen kan handmatige drempelwaarde-instelling nodig zijn vanwege ruis in de opnamekanalen. Verifieer vervolgens of de temperatuuroploping van de GC-run correct is.

In dit voorbeeld begint de temperatuur bij 50 °C gedurende vier minuten en stijgt deze vervolgens met 10 °C per minuut tot een eindtemperatuur van 220 °C, of wordt deze zes minuten vastgehouden. Wanneer de golfvormen van de eenheden in de opnamekanalen consistent zijn geworden, worden de neurale opnames als stabiel beschouwd. Zodra deze gestabiliseerd zijn, vult u de spuit met de geur van de florale headspace en injecteert u de geur in de injectiepoort van de gc.

Begin vervolgens onmiddellijk na afloop van de GC-run met de opname van de elektroden. Laat het preparaat vijf tot 15 minuten rusten. Injecteer daarna een nieuw monster in de GC of stimuleer het preparaat met enkelvoudige vluchtige verbindingen of mengsels van verbindingen.

Als de spontane activiteit op enig moment plotseling stopt of verandert, controleer dan het zoutoplossing-druppelsysteem en laat het preparaat 15 minuten rusten. Als de activiteit daarna niet terugkeert naar het vorige niveau, gooi het preparaat dan weg. Fixeer na het experiment de hersenen terwijl de probes nog in het weefsel zitten, snijd vervolgens de hersenen uit, spoel het fixatief weg en dehydrateer de hersenen.

De locaties van de opnamekanalen kunnen vervolgens worden geïdentificeerd met confocale microscopie vanuit de bloemgeur van mimus Luci. Het totale aantal vluchtige stoffen wordt bepaald. De GC bevat doorgaans tussen de 60 en 70 verbindingen.

De geur van Mimus Luci bestaat hoofdzakelijk uit monoterpenoiden, waaronder bèta myosin en alfa pinine. Het resterende deel van de geur bestaat uit vluchtige stoffen met zes koolstofatomen. Verschillende preparaten werden gestimuleerd met drie µL van het Mimus Lewis oogextract.

Deze opname van een van de acht neurale eenheden die zijn geregistreerd met de multikanaalelektrode laat zien hoe selectief een neuron reageert op specifieke vluchtige stoffen. In dit voorbeeld wordt die verbinding getoond. Hier zijn de responsen van acht neurale eenheden.

Ongeveer de helft van het ensemble reageerde niet. Dit is verrassend gezien de diversiteit aan vluchtige verbindingen die vrijkwamen uit de florale headspace, maar dit is consistent tussen de preparaten en wordt in andere studies gerapporteerd. De genormaliseerde vuursnelheid van de responsieve eenheden laat zien dat er een sterke selectiviteit is voor een groep geurstoffen.

De geurstoffen die door de pijlen worden aangewezen, riepen de meest robuuste reacties op. Dit zijn demine en trans bèta osain. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u uw insect voorbereidt op het experiment en vervolgens het experiment uitvoert met behulp van gaschromatografie met multikanaalsregistratie.

Het doel is vervolgens om vermoedelijk gedragsmatig effectieve geurstoffen in een complex boeket te identificeren. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in twee tot drie uur worden uitgevoerd indien deze procedure correct wordt gevolgd. Andere methoden, zoals gedragstesten met de geïdentificeerde geurstoffen, kunnen worden uitgevoerd om de effectiviteit van de vluchtige stoffen bij het mediëren van de gedragsrespons van het insect volledig vast te stellen.