Verbeterde visualisatie van longmetastasen bij Single Cell resolutie in Muizen van de gecombineerde

Het algemene doel van deze procedure is om de detectie van micrometastasen in de long van de muis ex vivo te verbeteren, terwijl de architectuur van de opgeblazen longen behouden blijft. Dit wordt bereikt door de long eerst in situ te perfunderen met PBS om het bloed te verwijderen, wat de belangrijkste bron is van kleurachtergrond in dat weefsel. De volgende stappen zijn het opblazen van de long door injectie van PFA, waarna deze wordt afgeknepen om het longweefsel onder inflatie te fixeren.

Vervolgens wordt de long verwijderd en verder gefixeerd in PFA, of worden individuele longlobben ingebed voor cryosectie. De laatste stappen bestaan uit het kleuren van de weefsels in Xal-oplossing en het visualiseren van de LA zag-tumorcellen; uiteindelijk kunnen metastasen in volledige longlobben of in longweefselcoupes tot op het niveau van individuele cellen worden gedetecteerd met een binoculair microscoop of een lichtmicroscoop. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de sky standing on its own, is dat de detecteerbaarheid van micrometastasen aanzienlijk is verbeterd door de verwijdering van bloedgerelateerde achtergrond.

Begin het protocol door een muis te anesthetiseren met een intraperitoneale injectie van ketamine, xylazine en acepromazine in ongeveer 150 µL PBS. Wanneer de pijnreflexen van de muis niet langer waarneembaar zijn, wordt deze gefixeerd op de operatietafel. Scheer de rugzijde en maak het haar glad met 70% ethanol.

Open de huid vanaf de buik tot aan de nek. Trek de huid naar de zijkanten of verwijder deze. Open voorzichtig het peritoneum in de thorax om ruptuur van grote vaten, zoals de venae jugulares, te voorkomen.

Dit zal de efficiëntie van de perfusie verbeteren. Snijd nu de vena cava cardis onder de lever door met een spuit van 20 milliliter voorzien van een naald met een gauge van 21 tot 24. Injecteer langzaam 10 tot 15 milliliter PBS in de rechterventrikel van het kloppende hart totdat de long volledig wit is en het hart stopt met kloppen.

Klem vervolgens de bloedvaten boven de lever en het diafragma af met een vaatklem. Vul een spuit van 10 milliliter met 3% paraformaldehyde en injecteer ongeveer twee milliliter in de rechterventrikel met een naald van 21 tot 24 gauge.

Leg de trachea buiten de thorax vrij en ventileer de long door vanuit de thorax ongeveer drie milliliters aldehyde in de trachea te injecteren. Knijp direct na het verwijderen van de naald de trachea af bij de punctiestelle met een vaatklem en wacht 10 minuten om fixatie mogelijk te maken. Transecteer vervolgens de bloedvaten boven de vaatklem.

Verwijder vervolgens de klem en injecteer ongeveer twee milliliters PBS in de rechterventrikel om overtollig formaldehyde te verwijderen. Puncleer de onderste delen van alle longkwabben met een naald en verwijder de vasculaire klem bij de trachea. Injecteer nu drie tot vijf milliliters verdunde inbeddingsoplossing in de trachea, in tegenovergestelde richting van de andere injectie.

Stop de injectie wanneer het paraformehyde in de longkwabben is vervangen door de oplossing. Verwijder de long zorgvuldig door het hart met een pincet naar buiten te trekken en door het bindweefsel, de ligamenten, de bloedvaten en de trachea door te snijden. Zorg ervoor dat het hart met de longen verbonden blijft.

Zet één lob opzij voor cryosneden en gebruik het resterende longweefsel voor kleuring van de gehele long. Plaats de long in een plastic beker met een goed sluitend deksel en fixeer deze met 2% formaldehyde en PBS. Leg een stukje gaas bovenop de long om deze in de oplossing te houden en laat dit 30 minuten bij kamertemperatuur staan.

Verwijder na een half uur de fixatieoplossing en was het weefsel grondig drie keer met PBS. Bereid de gebruiksklare Xal-oplossing vers door één milliliter Xal-stockoplossing in een verhouding van 1:40 te verdunnen in de basiskleuringsoplossing en voeg er ten minste 10 milliliters van toe aan het bakje. Dompel de long onder met een stukje gaas. Sluit het deksel losjes om luchtuitwisseling mogelijk te maken en incubeer het gedurende drie tot vijf uur bij 37 °C, beschermd tegen licht.

Verwijder na de incubatie de xal-oplossing. Spoel de longen eenmaal met PBS om resterende xal-oplossing te verwijderen en voeg ten minste 10 milliliters 4%paraform aldehyde in PBS toe. Het weefsel is nu klaar voor histologie en kan langdurig worden bewaard in de 4%PFA bij vier graden Celsius.

Begin met het vullen van één derde van een inbedmal met onverdund poly forze inbedmedium. Plaats vervolgens de longkwab in de mal en voeg medium toe totdat de kwab volledig is bedekt. Vermijd zorgvuldig de vorming van luchtbellen en incubeer de ingebedde kwab vervolgens gedurende 20 minuten bij 4 °C.

Bereid vervolgens de ingebedde longen voor op het maken van coupes door ze langzaam te bevriezen in een mengsel van droogijs en isopentaan. Indien nodig kunnen ze nu worden overgebracht naar een vriezer van -80 °C voor bewaring. Snijd op een cryostaat cryocoupes van 7 tot 10 micron van de lob. Monteer de coupes op commercieel verkrijgbare cryosectie-glazen. Zodra ze zijn gemonteerd, worden de coupes onmiddellijk 24 uur lang bij 37 °C geïncubeerd in XAL-kleuringsoplossing in een bevochtigde kamer. Spoel de glazen de volgende dag twee keer gedurende vijf minuten per spoelbeurt met PBS.

Volg dit met een kort spoelen in gedestilleerd water. Zet de coupes nu tegen met nuclear fast red gedurende 10 seconden om een zwakke tegenkleuring te verkrijgen waardoor de xal dominanter wordt, en spoel de tegenkleuring onmiddellijk af met gedestilleerd water. Voor een donkerdere tegenkleuring kan de tijd worden verlengd tot 30 seconden of langer.

Monteer de preparaten met immuno mount. De vorming van metastasen in de done LM eight muis-OS-modellen werd opnieuw onderzocht. Gebruik hiervoor de beschreven representatieve afbeeldingen van geperfuseerde en niet-geperfuseerde longen van muizen die gelijktijdig werden geïnjecteerd met laxy-getransduceerde en niet-getransduceerde controle done- en LM eight-cellen in muizen die werden geïnjecteerd met controle done-cellen.

Macroscopische en microscopische metastasen bleven ondetecteerbaar in niet-geperfuseerde en geperfuseerde longen. Interessant genoeg onthulde xgl-kleuring bij muizen die waren geïnjecteerd met dun LA Z-cellen echter blauwe micrometastatische foci van individuele cellen of kleine celclusters op het oppervlak van niet-geperfuseerde longen; in situ perfusie en fixatie van de longen verbeterden de detecteerbaarheid van dun la z-micrometastasen verder. De uitgroei tot macroscopische foci werd echter niet waargenomen bij muizen die waren geïnjecteerd met controle LM acht-cellen. Translucente, nauwelijks detecteerbare macro-metastatische foci met een diameter groter dan 0,1 millimeter werden herkend in niet-geperfuseerde longen. Perfusie van de longen verbeterde de detectie van de foci niet.

Echter, bij muizen die waren geïnjecteerd met ate LAC Z-cellen, werden meerdere X gal-blauw gekleurde macrometastasen gedetecteerd op het oppervlak van niet-geperfundeerde organen. Ook micrometastasen werden gedetecteerd op het oppervlak van niet-geperfundeerde organen. Bovendien verbeterde perfusie van de longen de detecteerbaarheid van macro- en micrometastasen verder.

Bijgevolg werden micro- en macrometastasen zichtbaar met een hogere dichtheid en in groter aantal, hoofdzakelijk door de translucentie van het geperfuseerde weefsel, waardoor ook foci onder het organoppervlak zichtbaar werden. Een aanvullende histologische analyse met cryosecties van longweefsel bevestigde de verbeterde detecteerbaarheid van longmetastasen bij muizen die waren geïnjecteerd met LAX Z-getransduceerde done- en LM eight-cellen, en bij muizen met primaire tumoren afgeleid van Dun LAX Z-cellen. Micrometastasen of zelfs single-cell foci werden herkend in de longsecties.

Dit werd niet waargenomen bij muizen met primaire tumoren van de respectievelijke controlecellen. Bovendien waren macro-metastasen duidelijker zichtbaar bij muizen die waren geïnjecteerd met LM eight LA C-cellen dan bij dieren met de controle LM eight-cellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het uitvoeren van longperfusie en fixatie in ZI twee en de daaropvolgende exci-kleuring van de metastasen in de uitgebeelde longen.

Deze techniek is een zeer gevoelige endpoint-meting voor de distributie van metastasen in de long bij elk type kankerstudie, en kan tevens dienen als benchmark voor de verbetering van huidige in vivo beeldvormingstechnieken, zoals micro CT, PET en MRI, die worden gebruikt voor de vroege detectie van metastatische laesies.