Een kwantitatieve evaluatie van celmigratie door de Phagokinetic Track Motiliteit Assay

Het algemene doel van deze procedure is om cellulaire motiliteit in de loop van de tijd kwantitatief te kunnen meten met behulp van een cellmotiliteitsassay op basis van goudnanodeeltjes. Dit wordt bereikt door eerst glazen dekglasjes voor te bereiden voor een coating met goudnanodeeltjes. Specifiek worden endotoxinevrije dekglasjes gecoat met gelatine en vervolgens gebakken.

De tweede stap is het reduceren van chloorzuur, waardoor goudnanodeeltjes ontstaan, en het gelijkmatig coaten van de met gelatine gecoate dekglasjes met de oplossing. Vervolgens worden de cellen voor de gewenste tijdsduur van het experiment op de met goudnanodeeltjes gecoate dekglasjes geplaatst. Daarna zal de gelatine de goudnanodeeltjes verplaatsen, waardoor er sporen ontstaan.

De laatste stap is het monitoren en kwantificeren van de celmotiliteit met behulp van microscopie om de sporen te visualiseren die door de bewegende cellen worden gecreëerd. Ten slotte worden oppervlaktemetingen van de sporen uitgevoerd met behulp van vrij beschikbare software. Een van de belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals time-lapse imaging, is dat deze assay slechts een standaard lichtmicroscoop en een standaardcamera vereist en gebruikmaakt van vrij beschikbare imaging-software.

Bovendien maakt de assay het eenvoudig mogelijk om meerdere monsters te analyseren en te vergelijken met behulp van een methode die geschikt is voor high-throughput screening. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de invloed van verschillende fysiologische factoren en celbeweging, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals studies naar de effecten van pathogenen op de motiliteit van geïnfecteerde cellen. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden, omdat de methode vereist dat de in het protocol aangegeven volumes en temperaturen strikt worden gevolgd.

In dit protocol ligt de nadruk op het beoordelen van de kleur van de uiteindelijke oplossing van geprecipiteerde goudnanodeeltjes om het succes te waarborgen. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen van de FGO-kinetische track-mobiliteitsassay moeilijk aan te leren zijn.

Ze bevatten verschillende procedures die niet gebruikelijk zijn in laboratoria voor cellulaire en moleculaire biologie. Om met gelatine gecoate dekglasjes voor te bereiden, resuspendeer eerst de gelatine en gedeïoniseerd water om een oplossing te maken met een uiteindelijke concentratie van 0,5 gram per 300 milliliters en autoclaveer vervolgens het mengsel gedurende 15 tot 30 minuten. Het is belangrijk om dit binnen twee uur na het toevoegen van de gelatine in een weefkweekkast te doen.

Bereid de dekglasjes voor op coating door eerst acht tot negen zuurgewassen dekglasjes over te brengen naar een plastic schaal van 100 millimeter. Zorg ervoor dat de dekglasjes elkaar en de wanden van de schaal niet raken. Pipetteer voorzichtig twee tot drie druppels gelatine op elk dekglasje, waarbij overvloeiing op de schaal wordt voorkomen.

Plaats vervolgens de schaal met de met gelatine gecoate dekglasjes in een oven en bak deze 10 minuten bij 90 °C. Haal de schaal na 10 minuten uit de oven en plaats deze terug in de weefselkweekkast.

Pipette voorzichtig het overtollige gelatine weg. Plaats de schaal terug in de oven en droog de dekglasjes 45 minuten lang bij 70 °C. Zodra de dekglasjes droog zijn, haalt u de schaal uit de oven en plaatst u deze terug in de weefselkweekkap.

Til met een steriele naald voorzichtig één zijde van het dekglas op. Gebruik vervolgens een steriele pincet om de met gelatine gecoate dekglasjes uit de schaal te verwijderen en plaats deze in afzonderlijke putjes van een 24-wells plaat. De volgende stap is het voorbereiden van met colloïdaal goud gecoate dekglasjes.

Begin met het bereiden van 10 milliliter 0,5% natriumcitraatoplossing in een weefselkweekkast door 1,5 milliliter van de 14,5 millimolaire chlooraurinezuuroplossing en 13,5 milliliter autoclaaf-gedeïoniseerd water te combineren in een steriele, endotoxinevrije Erlenmeyerkolf. Voor elke acht tot negen dekglasjes moet dit resulteren in een lichtgele oplossing. Chlooraurinezuur is toxisch en moet voorzichtig worden gehanteerd. Het is bovendien lichtgevoelig, waardoor de kookstap in een omgeving met weinig licht moet worden uitgevoerd.

Wanneer de oplossing het kookpunt heeft bereikt, haalt u de kolf van de warmteplaat en plaatst u deze op een roerplaat. Om de colloïdale gouddeeltjes in oplossing te vormen, voegt u onder roeren 0,7 milliliters van de 0,5% sodiumcitraatoplossing toe per 15 milliliters van de chloorzuurAu-oplossing en roert u nog ongeveer twee minuten door. Gedurende deze tijd zal de oplossing veranderen van lichtgeel naar helder, naar grijs, naar paars en uiteindelijk naar dieppaars.

Nadat een rode wijnkleur of bij voorkeur een roestkleur is bereikt, wordt de colloïdaal goudoplossing met een pipette van 10 milliliter opgenomen en mag de oplossing één tot twee minuten in de pipette afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg vervolgens 0,5 tot één milliliter toe op de met gelatine gecoate dekglasjes in de 24-wells plaat. Plaats de 24-wells plaat met de met colloïdaal goud bedekte dekglasjes in een incubator op 37 graden Celsius en incubeer gedurende 30 minuten. Nadat de partikels de tijd hebben gehad om neer te slaan op de met gelatine gecoate dekglasjes, wordt hun dichtheid onder een lichtmicroscoop gecontroleerd.

De juiste distributie van goudnanodeeltjes helpt om de randen van solar trucks eenvoudig en efficiënt te onderscheiden. De optimale dichtheid varieert per celgrootte. Een te hoge concentratie gouddeeltjes belemmert het vermogen van cellen om te bewegen, terwijl een te lage concentratie gouddeeltjes de mogelijkheid beperkt om een nauwkeurig motiliteitsspoor af te bakenen.

Om deze reden mogen alleen dekglasjes die uit dezelfde batch komen of die zijn geverifieerd om dezelfde dichtheid te hebben, samen worden gebruikt in individuele experimenten. Als de concentratie gouddeeltjes onvoldoende is, voeg dan nog eens 0,5 tot 1 milliliter van de colloïdaal goudoplossing toe aan de met gelatine gecoate dekglasjes. Indien de concentratie gouddeeltjes echter te hoog is, zoals in het hier getoonde geval, is de enige effectieve optie om de colloïdaal goudoplossing opnieuw te maken en nieuwe dekglasjes te coaten.

Als de particeldichtheid correct is, wordt de plaat teruggeplaatst in de incubator bij 37 °C en gedurende één uur tot overnacht geïncubeerd. Spoel vervolgens ongebonden goudpartikels weg door de dekglasjes drie keer te dopen in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing. Bewaar de met colloïdaal goud gecoate dekglasjes daarna in PBS-gevulde putjes van een schone 12-wells plaat bij 4 °C tot ze worden gebruikt. De dekglasjes mogen niet uitdrogen en dienen binnen twee tot drie maanden na de datum van vervaardiging te worden gebruikt.

De volgende stap is het voorbereiden van de met colloïdaal goud gecoate dekglasplaatjes voor celkweek. Begin hiermee door ze in individuele putjes van een 24-wells plaat te plaatsen waarin vooraf ongeveer 0,3 milliliters kweekmedium is toegevoegd. Breng vervolgens ongeveer 5.000 tot 50.000 cellen over naar elk met colloïdaal goud gecoat dekglasplaatje. Het aantal cellen zal variëren per celtype, maar de celdichtheid moet laag genoeg zijn om te voorkomen dat celsporen van meerdere cellen in hetzelfde gebied elkaar overlappen.

Dek de plaat af en plaats deze in een incubator bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende zes tot 24 uur. Op basis van de motiliteit van het celtype moet het optimale tijdsbestek experimenteel worden bepaald voor elk celtype. Fixeer na incubatie alle dekglasjes die niet onmiddellijk worden geanalyseerd door ze eerst twee keer in PBS te dippen, gevolgd door incubatie in 3% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Leg met een lichtmicroscoop beelden vast van de sporen die zijn achtergelaten door een enkele bewegende cel op niet-gefixeerde of gefixeerde dekglasjes. De vergroting die wordt gebruikt om foto's van de celsporen te maken varieert afhankelijk van het celtype. Om resultaten te kunnen vergelijken, moet echter voor elke studie dezelfde vergroting worden gehanteerd.

Voor monocyten werkt een 40-voudige vergroting goed; gebruik hiervoor gratis beschikbare software zoals ImageJ, JNIH Image of ImageTool om de gemiddelde oppervlakte van colloïdaal goud te bepalen die door 10 tot 20 of meer cellen is vrijgemaakt voor elk monster. In de hier getoonde opname is het vrijgemaakte pad van colloïdale gouddeeltjes door een enkele ongestimuleerde monocyt te zien, vastgelegd met een 40x objectief. Niet-motiele cellen creëren karakteristieke kleine ovale of cirkelvormige sporen rondom zichzelf, wat wijst op een laag basaal bewegingsniveau. In contrast hiermee worden zeer motiele cellen gekenmerkt door een directionele beweging in de vorm van verlengde sporen en grotere totale oppervlaktes vanwege hun onregelmatige vormen.

Celsporen worden bij voorkeur geanalyseerd door de freehand-tool in de Image J-software te gebruiken om hun volume om te trekken. Kwantitatieve oppervlaktemetingen kunnen vervolgens worden uitgevoerd met de measure-tool in het analysemenu van Image J. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om strikt de volumes en temperaturen te volgen die in het protocol zijn aangegeven, aangezien afwijkingen de uiteindelijke resultaten sterk kunnen beïnvloeden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u gelatinegecoate dekglasjes maakt, hoe u goudnanodeeltjes en goudnanodeeltjes-gecoate dekglasjes bereidt, en hoe u celbeweging monitort en kwantitatief evalueert met behulp van lichtmicroscopie.

Vergeet niet dat het werken met kokende oplossingen op een warmteplaat, en in het bijzonder de dampen van de kokende oplossing van fluoro-AIC-zuur en natriumcitraat, gevaarlijk kan zijn; er moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure, zoals het werken in een zuurkast en het gebruiken van gezond verstand.