On-Chip Endotheliale Inflammatoire Fenotypering

Het doel van deze video is om een lab-on-a-chip-techniek te demonstreren voor het karakteriseren van de inflammatoire status van endotheelcellen. Om te beginnen worden menselijke aortale endotheelcellen tot confluentie gekweekt op een weefselkweeksubstraat, waarna ze in een Conan-plaat afschuifapparaat worden geplaatst. De cellen worden behandeld met het pro-inflammatoire cytokine, TNF alpha, en gelijktijdig gedurende vier uur blootgesteld aan verschillende afschuifspanningscondities door de rotatie van de kegel boven het substraat nauwkeurig te regelen; afschuifspanning moduleert een goed gekarakteriseerde inflammatoire respons op cytokines.

Dat omvat de opregulatie van adhesiemoleculen zoals VCAM-1 en ICAM-1. Het substraat wordt overgebracht naar een microscooptafel waar een APDMS-microfluïdisch apparaat vacuüm wordt afgesloten op de monolaag, waardoor stroomkanalen ontstaan. Geactiveerde monocytaire THP-1-cellen worden over de geconditioneerde hse gestroomd, waarbij ze binden in proportie tot het niveau van de expressie van celadhesiemoleculen.

De ontstekingsstatus van het endotheel wordt bepaald door het totale aantal THP-1-cellen te kwantificeren dat stevig is gehecht. Hallo, mijn naam is She D Diverse, ik ben Greg Foster en ik ben Keith Bailey.

We bevinden ons in de laboratoria van professoren Pastor en Simon van de afdeling Biomedical Engineering aan de University of California in Davis. Vandaag gaan we het gebruik beschrijven van een lab-on-a-chip-benadering om endotheeldisfunctie en ontsteking kwantitatief te onderzoeken. Deze instrumenten bieden ons een platform om studies uit te voeren naar de superpositie van metabole stress met hydrodynamische factoren, en de regulatie van het inflammatoire fenotype van het endotheel en de vatbaarheid voor atherosclerose.

We noemen onze apparaten vasculaire mimetische microfluïdische kamers, of vmmc. Deze apparaten stellen ons in staat om inflammatoire uitkomsten in endotheelcellen en monocyten te kwantificeren onder omstandigheden die die in atherogene vaten nabootsen. De VMMC vergemakkelijkt het gebruik van kleine hoeveelheden reagentia of materialen die mogelijk slechts in beperkte mate beschikbaar zijn.

Ze kunnen bovendien worden vervaardigd in verschillende aanpasbare lay-outs en geometrieën, waardoor ze zeer geschikt zijn voor een breed scala aan toepassingen. Vandaag demonstreren we een representatief experiment met behulp van onze lab-on-a-chip-benadering. Humane endotheliale monolagen worden blootgesteld aan cytokine-activatie onder goed gedefinieerde schuifspanningen.

We zullen het gebruik van VMC demonstreren om de rekrutering van humane monocyten naar de monolayer in real-time te kwantificeren als functionele readout van endotheelactivatie. Met behulp van een draaibank worden cirkelvormige substraten van drie inch gefreesd uit 100 millimeter weefselkweekschalen. De substraten van drie inch worden gewassen met gedestilleerd water en vervolgens gesteriliseerd door ze te weken in 70% ethanol. De steriele substraten worden in 100 millimeter Petrischalen geplaatst en aan de lucht gedroogd.

Vervolgens worden ze gedurende één uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met type I collageen in een concentratie van 100 µg/mL en gewassen met PBS. Humane aortale endotheelcellen of HA worden gesuspendeerd in een concentratie van 650.000 cellen/mL. Eén milliliter van de celsuspensie wordt in druppels op een gedroogd, collageen-gecoat substraat aangebracht en uitgespreid tot een gelijkmatige suspensie.

De geplaatste substraten worden vervolgens in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 geplaatst, zodat de cellen kunnen hechten aan het substraatoppervlak. Na één uur worden negen milliliter EGM-2 groeimedium toegevoegd en krijgen de cellen de kans om uit te groeien tot monolagen. Bij een confluentie van ongeveer 90% zijn de monolagen klaar voor gebruik in daaropvolgende shear-experimenten. Vasculaire mimetische microfluïdische kamers worden vervaardigd door PDMS over een mastervorm te gieten die de gewenste kanaalgeometrie bevat.

Siliconenbasis wordt in een plastic weegbakje gegoten, gevolgd door het siliconen uithardingsmiddel in een gewichtsverhouding van 10 op 1. De PDMS-gel wordt vervolgens goed gemengd, waarbij er nauwlettend wordt toegezien dat de wanden van het weegbakje niet worden geschraapt om te voorkomen dat er plastic splinters in het mengsel terechtkomen. Photoresist-masters worden gereinigd met hexaan en klaargemaakt voor het gieten van de VMMC.

Het PDMS-mengsel wordt vervolgens over de mastervorm gegoten en daarna in een vacuümkamer geplaatst. In de kamer wordt de lucht uit het PDMS-mengsel verwijderd en stijgt na 15 minuten naar het oppervlak.

De mal wordt uit de kamer verwijderd en er wordt voorzichtig lucht over het PDMS-oppervlak geblazen om resterende luchtbellen uit de mal te verwijderen. De mal wordt vervolgens afgedekt en gedurende één uur in een oven van 37 °C geplaatst, waar het PDMS kan uitharden. Verwijder de gestolde PDMS-gel uit de oven en maak met een klein scalpel cirkelvormige incisies rond de kamer.

Het is essentieel om dit geleidelijk te doen om contact met het fotolakmateriaal te vermijden, aangezien dit de mastermatrijs zal beschadigen. Snijd de microfluïdische kamer uit de openingen van de matrijspons voor de in- en uitlaatpoorten van elk kanaal met een 19 gauge lure lock naald. PONS daarnaast gaten voor de vacuümbuizen buiten de kanalen.

De voorbereiding voor de VMMC is nu voltooid. Pipetteer het pro-inflammatoire cytokine TNF alpha in zes milliliter L 15-medium om een eindconcentratie van 0.5 nanogram per milliliter te bereiken. L 15-medium wordt hier gebruikt als afschuifvloeistof vanwege de pH-bufferende werking in afwezigheid van 5%CO2.

Het medium wordt vervolgens opgezogen in een steriele spuit van 10 milliliter, die wordt gebruikt om het afschuifapparaat te vullen. De convergente monolaag wordt vervolgens overgebracht naar het cel-afschuifapparaat, dat met ethanol is gesteriliseerd, is genivelleerd en waarvan de kegelsplethoogte is ingesteld. Het substraat wordt uit de Petrischaal verwijderd, gecentreerd op het glazen maatblok geplaatst en voorzichtig in de bodem van de behuizingskamer ingebracht, zodat de kegel zich direct boven de cellen bevindt.

Het substraat wordt vastgezet door de roestvrijstalen schroeven rond het blokje gelijkmatig aan te draaien. Het afschuifmedium wordt vervolgens in de kamer geladen, waarbij er zorgvuldig wordt toegezien dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd. Vervolgens wordt een computer gebruikt om het gewenste afschuifspanningsprogramma in te voeren en wordt de micro-stappenmotor ingeschakeld.

Hier maken we gebruik van een oscillerende afschuiving van nul plus of minus vijf dyne per vierkante centimeter. Na vier uur wordt het afschuifprogramma gestopt. Het vulblok wordt verwijderd en het substraat wordt voorzichtig teruggeplaatst in de Petrischaal.

De cellen zijn nu klaar voor de monocyten-adhesietest. Direct na het afscheren worden de HA-monolagen naar het microscopiestation getransporteerd voor de assemblage van de VMMC. De VMMC wordt aan de vacuümslang bevestigd en ondergedompeld in DI-water om eventuele luchtbellen in de kanalen te verwijderen.

Terwijl de vacuümkraan aanvankelijk gesloten is, wordt de kamer voorzichtig op de monocouche gedrukt en wordt de vacuümkraan geopend. Het is hierbij cruciaal om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de kanalen van de kamer zijn ingesloten. Vervolgens worden 80 µL HBSS met calcium en magnesium gepipetteerd in een reservoir, gemaakt door de punt van een 19 Gauge Luer Lock-naald af te knippen. De vloeistof wordt uit de punt geperst door stevig op de bovenkant van het reservoir te drukken, waarna dit in de inlaatpoort van de VMMC wordt geplaatst.

De gehele opstelling wordt op de objecttafel van de microscoop geplaatst en de microscoopcamera en videomonitor worden ingeschakeld. Een glazen spuit van 10 milliliter wordt in de spuitpomp geplaatst. Vervolgens wordt de slang van de spuit aangesloten op de uitlaatpoort van de VMMC.

De stroomsnelheid wordt ingesteld om een schuifspanning van één dyne per vierkante centimeter in het kanaal te induceren, waarna het systeem in vulmodus wordt gezet zodat de spuit vloeistof vanuit het reservoir door het kanaal trekt. De PH one-cellen die gestimuleerd zijn met SDF one zijn gesuspendeerd in een concentratie van 2 miljoen cellen per milliliter. Binnen twee minuten na de activering van de stroom worden 50 µL van de celсусpensie aan het reservoir toegevoegd.

Zorg er opnieuw voor dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd zodra de stroming volledig is ontwikkeld. De video wordt opgenomen met drie frames per seconde en de gegevens worden geteld met behulp van Image J-software. Adherente THP-1-cellen worden gedefinieerd als cellen die in 10 seconden niet meer dan een halve celdiameter bewegen.

Hier tonen we data die de adhesie van THP-1 aan ha-monolagen uitbeelden, gestimuleerd met TNF-alpha en geconditioneerd onder respectievelijk een constante hoge wandschuifspanning van 15 dyn/cm² of een oscillerende schuifspanning van 0 ± 5 dyn/cm². Ha-monolagen geconditioneerd met oscillerende schuifspanning vertoonden een drievoudige toename in THP-1 celrekrutering vergeleken met monolagen die waren blootgesteld aan een hoge schuifspanning. Vandaag demonstreren we het gebruik van aanpasbare in vitro technieken die gecombineerd kunnen worden om belangrijk inzicht te verschaffen in vroege inflammatoire gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan atherosclerose. Specifiek kwantificeren we uitkomsten geassocieerd met endotheeldisfunctie en cellen die zijn blootgesteld aan inflammatoire stimuli onder goed gedefinieerde hydrodynamische condities.

Het gebruik van VMM CS stelt ons in staat om specifieke mechanismen te onderzoeken die ten grond liggen aan de adhesie-interacties tussen endotheelcellen en leukocyten. Deze apparaten hebben bovendien het voordeel dat ze flexibel en goedkoop zijn en vergemakkelijken het gebruik van materialen waarvan de beschikbaarheid beperkt kan zijn, zoals serumafgeleide componenten van menselijke proefpersonen. Onze studies waarbij deze apparaten zijn toegepast, omvatten onderzoeken naar cytokine-, lipide- en rage-geïnduceerde ontsteking in endotheelcellen.

We hebben ook on-chip assays ontwikkeld om adhesiemechanismen in meerdere leukocyttypen en in volbloed te onderzoeken. Uiteindelijk voorzien we dat deze technologie zal leiden tot ex vivo benaderingen voor het beoordelen van het risico van een individu op door ontsteking gemedieerde cardiovasculaire ziekten.