Een eenvoudig protocol voor het extraheren van hemocyten van Wild Rupsen

Het algemene doel van deze procedure is om hemocyten uit wilde rupsen te extraheren, te visualiseren en te tellen. Dit wordt bereikt door de rups eerst te anesthetiseren door deze op ijs te plaatsen, een buffersolution met een antistollingsmiddel te injecteren en de rups terug op het ijs te plaatsen zodat de hemocyten opnieuw in de circulatie kunnen komen voordat de extractie plaatsvindt. De tweede stap is het maken van een ondiepe incisie aan het posterieure uiteinde van de rups met een schoon scalpel.

Vervolgens wordt de rups voorzichtig samengedrukt met een zachte pincet. Daarna wordt het mengsel van bufferoplossing en hemolymfe opgezogen met een micropipet en opgevangen in een microcentrifugebuisje. De laatste stap is om de hemolymfe-oplossing voorzichtig te mengen met een gelijk volume bufferoplossing en 10 µL van de oplossing over te brengen naar een hemocytometer om de hemocyten te visualiseren en te tellen.

Uiteindelijk kan deze methode voor hemocyt-extractie worden gebruikt als een snelle en effectieve manier om hemocyten van diverse rupsensoorten te tellen en kan deze dienen als instrument om fysiologische aspecten van de cellulaire immuunrespons van de insecten te onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden toegepast om hemocyten te extraheren uit rupsen met een sterk gereduceerd prolegion. Andere rupsmodellen worden bebloed door een van de prolegia door te snijden, waarna de hemocyten uit de uitstromende vloeistof worden geëxtraheerd.

Daarnaast kan deze techniek worden gebruikt om hemocieten te extraheren uit andere insectensoorten. Deze methode kan worden toegepast om kernvragen op het gebied van eco-immunologie te beantwoorden, zoals de wijze waarop de cellulaire immuunrespons van het insect varieert afhankelijk van de kwaliteit van het dieet, het ontwikkelingsstadium of de blootstelling aan verschillende pathogenen. Om met deze procedure te beginnen, worden de larven in het voorlaatste stadium geanestheseerd door ze 20 minuten op ijs te koelen voorafgaand aan de extractie van hemocieten.

Plaats daarna het stompe uiteinde van een schone capillaire naald van 16 gauge in de slang die is verbonden met een glazen spuit van 20 milliliter. Laat de buis met de opvangoplossing openstaan op de laboratoriumbank. Vul de capillair langzaam met ongeveer 10 tot 15 µL buffer.

Plaats de naald vervolgens op een balletje klei dat naast het dissectiemicroscoop is geplaatst. Plaats de rups in een Petrischaal. Het insect moet op zijn zij worden gepositioneerd zodat de sferulen duidelijk zichtbaar zijn.

Terwijl u door een dissectiemicroscoop kijkt, houdt u de rups op zijn plaats met een pincet en plaatst u de naald dicht bij een van de sferulen, waar de insectencuticula over het algemeen zachter is. Druk vervolgens de capillaire naald voorzichtig tegen het lichaam van het insect. Zodra de naald door de cuticula is gedrongen, injecteert u het totale volume van de oplossing in de rups.

Het lichaam van de rups zal na de injectie opzwellen, maar mag niet knappen of lekken. Plaats de rups terug in de gekoelde Petrischaal. Positioneer het insect op de rug om te voorkomen dat de buffer uit de wond lekt.

Herhaal de injecties voor elke rups die wordt gebruikt voor de extractie van hemolymfe. Laat alle insecten vervolgens 30 minuten op ijs afkoelen. Plaats de rups nu in een Petrischaal onder de dissectiemicroscoop.

Maak voorzichtig een ondiepe incisie van ongeveer twee tot drie millimeter lang in de posterieure regio van de rups, met een steriel scalpel, zonder het darmkanaal of andere interne organen te beschadigen. Knijp vervolgens de rups voorzichtig samen met een flexibele plastic pincet, terwijl u ongeveer 10 tot 20 µL van de hemolymfe opvangt met een pipetpunt van 10 µL. Let hierbij opnieuw op dat het interne weefsel niet wordt beschadigd.

Gooi daarna de resten van de rupsen weg. Verzamel de hemolymfe van elke rups in afzonderlijke gelabelde gesiliconiseerde microcentrifugebuisjes van 0,5 milliliter. Voeg vervolgens ongeveer 10 tot 20 µL van de incubatieloplossing toe aan elk hemolymfemonster dat van een individuele rups is verzameld.

Houd de hemolymfmonsters tijdens deze stap constant op ijs. Meng het hemolymfmonster en de incubatielosning onmiddellijk vóór het tellen van de hemocyten.

Deze behandeling maakt een correcte scheiding van de hemocyten mogelijk en voorkomt klontering. Gebruik een schone pipetpunt om 10 µL van het hemolymfemonster, gemengd met de incubatielosung, over te brengen naar een hemocytometer. Tel vervolgens met een compoundmicroscoop het aantal hemocyten in ten minste 15 van de grote vierkanten van het centrale raster van de hemocytometer en noteer dit.

Tel deze waarden op om het totaal aantal hemocyten in de 15 vierkantjes te verkrijgen. Spoel vervolgens de hemocytometer en het dekglas grondig af met een spoelfles met gedestilleerd en gedeïoniseerd water. Maak ze daarna droog met Kim wipes.

Herhaal de procedures voor de resterende hemolymfenmonsters en bereken het gemiddeld aantal hemocyten per milliliter hemolymfevolume voor elke rups. De brightfield-microscopie-afbeelding toont de geëxtraheerde hemocyten van nucle hin ai-rupsen bij een 20 x vergroting. Na deze procedure kunnen de verzamelde hemocyten worden gebruikt om de cellulaire immuunrespons te bestuderen en assays op te zetten, zoals fagocytose, cap-selectieve inkapseling en pH-oxidase-activiteit.

Daarnaast kunnen ongebruikt RNA, DNA en eiwit worden verzameld voor verdere analyses om deze cellulaire immuunrespons bij insecten te bestuderen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe rupsen moeten worden geïnjecteerd met het doel hemolymfe te extraheren en hoe hemolymfe met levende hemocyten moet worden verzameld.