Een PCR-gebaseerde genotyperingsmethode onderscheid te maken tussen wild-type en Sier Rassen van Imperata cylindrica

Het hoofddoel van deze procedure is het bieden van een kosteneffectief en snel moleculair genotyperingsprotocol waarmee onderscheid kan worden gemaakt tussen variëteiten van Retta cylindrica, gewoonlijk gongras genoemd, die op basis van morfologie alleen niet van elkaar te onderscheiden zijn. Dit wordt bereikt door eerst weefsel van een relevante variëteit gongras te identificeren en te isoleren. De volgende stap is het extraheren van nucleair en plastide DNA uit het verzamelde weefsel.

Vervolgens wordt een polymerasekettenreactie uitgevoerd op het geëxtraheerde DNA met variëteitsspecifieke primers die gericht zijn op sequentieverschillen in de PLAs turn LF-regio, samen met passende positieve en negatieve controles. De laatste stap is het uitvoeren van gelelektroforese op elk van de vier PCR-reacties om de geamplificeerde PCR-producten te visualiseren. Uiteindelijk wordt de variëteit van het verzamelde gon-gras bepaald door analyse van de resulterende variëteitsspecifieke PCR-productbanden op de gel. Invasieve planten kosten de Verenigde Staten jaarlijks ongeveer 3,4 miljard, wat aanzienlijke schade toebrengt aan zowel landbouwkundige als natuurlijke hulpbronnen.

Het wilde type Imperata cylindrica, ook wel bekend als Cogan grass, is een van de 10 ergste invasieve onkruiden ter wereld. Cogan grass verspreidt zich snel in monocultures die inheemse vegetatie verdringen en daarmee ook de dieren die van die inheemse vegetatie afhankelijk zijn. Cogan grass besmet momenteel 490 miljoen hectare wereldwijd en ongeveer 500.000 hectare in de Verenigde Staten. Een sierrasvariant van Imperata cylindrica wordt op grote schaal vermarkt onder de namen Imperata cylindrica, Arbra, Red Baron en Japanese blood grass, wat we hierna JBG zullen noemen. Deze variëteit is vermoedelijk steriel en niet-invasief, en wordt gewaardeerd om zijn rood gekleurde bladeren.

Onder bepaalde omstandigheden kan Japans bloedgras levensvatbare zaden produceren en terugkeren naar een geheel groene vorm die niet te onderscheiden is van het wilde type cogongrass. Zoals u kunt zien, hebben ze beide groene bladeren en zijn ze groter dan de traditionele sierteeltvariant, met grotere bladeren. Daarnaast hebben de teruggekeerde en het wilde type planten grotere rhizomen, wat het aseksuele reproductiepotentieel van de sierteeltvariant vergroot.

De terugval maakt identificatie op basis van morfologie alleen tot een moeizame taak. Moleculaire methoden bieden een manier om invasieve planten en plantmateriaal dat niet via normale visuele middelen kan worden geïdentificeerd, nauwkeurig te onderscheiden.

Moleculaire methoden zijn essentieel om de verspreiding en introductie van invasieve planten tegen te gaan. Toepassing van dit moleculaire protocol biedt een manier om Japanese blood grass-terugslagen nauwkeurig te onderscheiden van Kogan grass. Dit protocol kan helpen om co-occurence met Kogan grass en de mogelijke vorming van levensvatbare hybriden te voorkomen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken, zoals amplified fragment length polymorphism (AFLP-analyse) en DNA-sequencing, is dat het een zeer kosteneffectieve en snelle moleculaire genotyperingsmethode biedt waarmee het verschil tussen wild-type kogan grass en variëteiten van Japanse bloedgras eenvoudig kan worden onderscheiden. De techniek zal worden gedemonstreerd door Joseph Hery, een student uit ons laboratorium. Identificeer eerst een specimen van een locatie waar kogan grass of Japans bloedgras groeien en waarbij onderscheid moet worden gemaakt tussen de twee.

Japanse bloedgras is gemakkelijk te onderscheiden van wildtype Kogan-gras door de helderrode bladeren. Echter, de revert van Japanse bloedgras is bijna niet te onderscheiden van Kogan-gras, aangezien ze beide langere groene bladeren, een groter bladoppervlak en grotere rhizomen hebben dan het siergras van de Japanse bloedgras. Deze methode kan worden toegepast op verse, bevroren en recent gedroogde bladweefsels.

Indien weefsels worden bewaard voor DNA-extractie op een latere datum, is de beste methode om het weefsel onmiddellijk bij minus 80 °C te bevriezen en te bewaren. Als droge bewaring noodzakelijk is, plaats het weefsel dan in een papieren envelop en bewaar de envelop bij kamertemperatuur in gedehydrateerde silicagel of andere actieve droogmiddelen. Indien vers weefsel wordt gebruikt, dient men ervoor te zorgen dat het DNA binnen drie uur na afname wordt geëxtraheerd om degradatie te voorkomen.

Deze procedure maakt gebruik van de DNEZ plants mini kit van Kyogen volgens de instructies van de fabrikant met één kleine aanpassing. De procedure is aangepast zodat er meer dan 100 milligram vers of bevroren weefsel, of meer dan 20 milligram gedroogd weefsel wordt gebruikt. Maal eerst meer dan 100 milligram vers of bevroren bladweefsel, of meer dan 20 milligram droog bladweefsel, tot een fijn poeder met drie rondes vloeibare stikstof en vermaling in een gekoelde vijzel en stamper.

Weeg het bevroren poeder van vers of bevroren weefsel af in aliquots van 100 milligram. Indien er droog bladweefsel wordt gebruikt, weeg het poeder dan af in aliquots van 20 milligram. Voer na deze stap de DNA-extractie uit volgens de instructies van de fabrikant met behulp van een spectrophotometer, zoals de NanoDrop spectrophotometer test; voor een goede DNA-kwaliteit en -kwantiteit moeten de DNA-opbrengsten tussen de 50 en 150 nanograms per microliter liggen, met 260/280 en 230/280 ratios dicht bij 2,0, zoals hier wordt getoond.

Voer elektroforese uit met een standaard 1%AROS-gel. Verifieer de aanwezigheid van relatief grote banden groter dan 10 KB met weinig tot geen uitstretching door RNA-contaminatie; indien de DNA-concentratie hoog is, verdun de monsters tot 70 nanogram per microliter voor de volgende stappen. De PCR-primers die in dit protocol worden gebruikt, aangegeven door de rode en groene pijlen, zijn gebaseerd op sequentieverschillen tussen de plastered turn LF-spacerregio van Cogan-gras en Japanse bloedgrasgenotypen.

Deze verschillen zijn aanwezig in de vorm van enkelnucleotide-polymorfismen en inserties en deleties, aangegeven door de verticale zwarte pijlen, waardoor de ontwikkeling van varieteitspecifieke primers mogelijk is. Door de primers te positioneren op de locaties van unieke sequenties, worden de primersequenties opgenomen in het geschreven gedeelte van het protocol voor elk geïsoleerd DNA-monster. Zet twee PCR-reacties van 50 µL op in 0,2 mL dunwandige PCR-buisjes op ijs, waarbij elke primer-set wordt gebruikt volgens het geschreven protocol. Als de DNA-concentratie laag is, kan er meer DNA aan elke reactie worden toegevoegd, waarbij de hoeveelheid nucleasevrij dubbel gedestilleerd water wordt aangepast zodat het totale reactievolume 50 µL blijft.

Gebruik niet meer dan 5 µL DNA of 10% van het totale volume per reactie, aangezien onzuiverheden in de DNA-monsters de PCR-reacties kunnen remmen. Om er zeker van te zijn dat alle PCR-reagentia correct werken, dient een positieve controle te worden ingericht. Gebruik voor de negatieve controle dezelfde set controleprimers als voor de positieve controle, maar gebruik dubbel gedestilleerd water in plaats van het geëxtraheerde DNA; op dit punt zijn er in totaal vier PCR-reacties per te testen monster. Voer vervolgens de PCR-amplificaties uit in een thermocycler met een verwarmde klep, gebruikmakend van de PCR-cyclusparameters in het geschreven protocol. Afhankelijk van de kwaliteit van het DNA, de primers, de Taq-polymerase of het type gebruikte thermocycler, kan optimalisatie van de annealingtemperatuur, de extensietijden en het aantal cycli noodzakelijk zijn.

Zodra de PCR-reacties zijn voltooid, worden de PCR-producten gescheiden op een 1% gel met behulp van standaard elektroforese. Laat de monsters lopen bij ongeveer 120 volt totdat het DNA-front drie kwart van de totale lengte van de gel heeft bereikt. Visualiseer de gel onder UV-licht en inspecteer de resulterende banden om te controleren of een passend DNA-fragment is geamplificeerd.

Deze representatieve gel toont de resultaten van elektforese van PCR-producten afgeleid van DNA-monsters van Kogan-gras, Japans bloedgras en Japans bloedgras-revert in combinatie met Kogan-gras- en JBG-specifieke primers, evenals de turn LF positieve controle en een negatieve controle zonder template. De primer-set van de turn LF positieve controle werkt even goed voor Kogan-gras, Japans bloedgras, Japans bloedgras-revert en andere grassen, en zal resulteren in een band van 890 basenparen. Als alle PCR-reagentia vrij zijn van DNA-contaminanten, zal de negatieve controle-reactie niet resulteren in een PCR-product.

Indien het DNA-monster is afkomstig van wildtype kogan grass, zal een PCR-reactie met de primerset specifiek voor kogan grass resulteren in één enkele band van ongeveer 595 baseparen, terwijl de JBG-specifieke primers geen band zullen opleveren. Op dezelfde wijze zal, indien het DNA-monster is afkomstig van JBG of een gereverteerde J-B-G-A-P-C-R-reactie, het gebruik van de JBG-specifieke primerset resulteren in één enkele band van ongeveer 594 baseparen, terwijl de primerset specifiek voor kogan grass geen band zal opleveren.

Omdat JBG en teruggevallen JBG een identieke nucleïnezuursequentie hebben, zullen zij derhalve identieke bandpatronen vertonen. De morfologische verschillen tussen JBG en JBG-revertenten zijn echter vrij duidelijk, waardoor de JBG-variëteiten op plantniveau gemakkelijk van elkaar te onderscheiden zijn, hoewel de PCR-resultaten hetzelfde zullen zijn. DNA-sequencing van de PCR-producten kan mogelijke veranderingen in de DNA-sequenties voor verschillende ecotypen van cogongrass identificeren.

De ontwikkeling van deze techniek biedt de eerste vereenvoudigde moleculaire methode die accuraat onderscheid kan maken tussen het wildtype K-gras en de teruggevallen vorm van de sierteeltvariant Japans bloedgras. We moedigen gebruikers van dit protocol aan om contact met ons op te nemen om de resultaten te rapporteren die voortvloeien uit het gebruik van dit protocol. Dergelijke gedeelde informatie zal helpen bij het verschaffen van gegevens over de verspreiding van Japans bloedgras.

Dit zal toezichthouders bij het USDA ook helpen om geïnformeerde beslissingen te nemen over maatregelen die mogelijk nodig zijn om de verspreiding en potentiële hybridisatie van de zeer invasieve variëteiten van Cogan-gras te voorkomen.