Zuivering en Aggregatie van het amyloïde voorlopereiwit intracellulaire domein

Het doel van deze procedure is het zuiveren van het intracellulaire domein van het amyloid precursor-eiwit, ook bekend als A ICD, en het presenteren van een protocol voor thermische aggregatie en karakterisering van A ICD middels atoomkrachtmicroscopie. Dit wordt bereikt door eerst een A GST-fusie van A ICD tot expressie te brengen in bacteriën. Vervolgens wordt het G-S-T-A-I-C-D-eiwit gezuiverd en gesplitst met trombine om GST van A ICD te scheiden, waarna GST wordt verwijderd.

Vervolgens wordt de thermische aggregatie van A ICD geïnduceerd. Ten slotte worden de A ICD-aggregaten in beeld gebracht met behulp van atoomkrachtmicroscopie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen dat A ICD tot homogeniteit kan worden gezuiverd in een hoeveelheid die voldoende is voor biochemische en biofysische analyse.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, die complexe chromatografiestappen vereisen, is dat een zeer zuiver en oplosbaar ICD op de werkbank kan worden geïsoleerd met gebruik van standaardreagentia en apparatuur. Een ICD die met dit protocol is geproduceerd, is geschikt voor verdere biochemische en biofysische karakterisering.

Amina ti zal de procedure demonstreren. Dr. Andres Oberer, een voormalig postdoc in mijn laboratorium, zal demonstreren hoe atomic force microscopy imaging van A ICD wordt uitgevoerd. Om het recombinante A PP intracellulaire domein of A ICD tot expressie te brengen, begint u met BL 21 cellen die zijn getransformeerd met de pgx 41 vector, die het menselijke A ICD bevat gefuseerd aan de C-terminus van GST. Inoculeer met een enkele kolonie 10 milliliters LB-bouillon met ampicilline en incubeer dit de volgende ochtend gedurende de nacht bij 37 °C met krachtig schudden.

Incubeer 400 milliliters LB ampicilline in een kolf van één liter met vijf milliliters van de overnight-cultuur. Incubeer bij 37 °C met krachtig schudden totdat de optische dichtheid bij 600 nanometers 0,4 tot 0,6 heeft bereikt. Dit duurt normaal gesproken twee tot 2,5 uur om de expressie van G-S-T-A-I-C-D te induceren.

We voegen 0,4 millimol IPTG toe en incuberen bij 37 °C met krachtig schudden gedurende vijf uur. Centrifugeer de cellen bij 6.000 ×g gedurende 15 minuten bij 4 °C en bewaar het pellet bij -80 °C. Na het bereiden van de lysisbuffer en het koelen van de bacteriën op ijs, voegen we 20 ml buffer toe aan het pellet en mengen we dit grondig met een pipette door een combinatie van vortexen en resuspenderen op ijs.

Resuspendeer het bacteriële pellet en breng het geresuspendeerde bacteriële lysaat door een vooraf gekoelde emulsificator of French press. Laat het lysaat bij 30,000 PSI een tweede keer door de emulsificator gaan en verzamel het lysaat in een vooraf gekoelde buis van 50 milliliter. Centrifugeer het lysaat bij 15,000 ×g en 4 °C gedurende 30 minuten.

Scheid het supernatant en breng dit over in een vooraf gekoelde buis van 50 milliliter. Voeg 500 microliters van een 50% slurry van glutathione arose toe. Draai het monster gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius terwijl het monster roteert.

Maak verse elutiebuffer na de incubatie. Giet het lysaat en het slurry in een wegwerpbare polystyreen chromatografiekolom van vijf inch met grove filters. Was de kolom vijf keer met 3 mL PBS.

Sluit de onderkant van de kolom af en voeg 500 µL elutiebuffer op kamertemperatuur toe. Sluit de bovenkant van de kolom af en roteer deze vijf minuten bij kamertemperatuur. Verzamel het eluaat in een gekoelde microcentrifugebuis van 1,5 mL.

Herhaal de elutie nog twee keer. Dialyseer het eluaat in een dialysemembraan met een molecular weight cutoff van 10.000 in vier liter PBS gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Dialyseer de volgende dag tegen nog eens vier liter PBS bij vier graden Celsius gedurende één uur.

Verwijder het eiwit uit de dialysecassette en voer een eiwitkwantificatie-assay uit om de opbrengst van G-S-T-A-I-C-D te bepalen. Een typische zuivering uit 400 milliliters kweek resulteert in opbrengsten van meer dan 20 milligrams gezuiverd eiwit met concentraties van 10 tot 20 milligrams per milliliter. Verdeel het eiwit in aliquoten van 200 microliter en vries deze in bij minus 80 degrees Celsius.

Om de A ICD vrij te maken van de GST-tag, worden 200 µL gezuiverd G-S-T-A-I-C-D toegevoegd aan 20 µL trombine met een concentratie van 1 unit per µL; incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C. Verwijder de volgende dag eventueel geaggregeerd materiaal door centrifugatie bij 20.000 ×g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Draag het supernatant over naar een vooraf gekoelde microtubus om GST en trombine te verwijderen. Voeg vervolgens respectievelijk 50 µL van een 50% glutathion-agarose slurry en 50 µL van een 50% protein A/G-agarose slurry toe.

Incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur onder rotatie. Centrifugeer kort om de agro beads te sedimenteren en breng het supernatant over naar een nieuwe buis. Extraheer de GST nog vier keer met glutathion.

Aros voert een eiwitkwantificeringsanalyse uit op vijf µL van het gezuiverde A ICD. Typische opbrengsten uit een cultuur van 400 mL zijn 50 tot 100 µg bij een concentratie van 0,2 tot 0,5 mg/mL. Na het verdunnen van vers bereid A ICD in PBS tot een concentratie van 0,1 mg/mL werd thermische aggregatie geïnduceerd door de monsters 48 uur lang te incuberen bij 43 °C bij 800 RPM in een verwarmde schudmachine.

Verdun het monster 20 maal met gedeïoniseerd water en breng twee µL aan op vers gekloofde mica. Droog het monster overnight in een desiccator om de geaggregeerde Aβ ICD te visualiseren. Gebruik atoomkrachtmicroscopie in tapping-modus met goudgecoate nitride-cantilevers met een nominale tipstraal van 2 nm.

Typische tikamplitudes tijdens beeldvorming bedragen 10 tot 20 nanometers bij de resonantiefrequentie van de cantilevers. De expressie en relatieve verrijking van G-S-T-A-I-C-D worden hier getoond. Na lyse bevindt het grootste deel van het fusie-eiwit zich in de oplosbare fractie, waardoor extractie uit inclusion bodies niet nodig is.

Het materiaal dat van de glutathion-affiniteitskolom is geëluëerd, is meer dan 95% zuiver. In de hier getoonde preparatie was de concentratie van het van de kolom geëluëerde eiwit 14,5 mg/mL en was de opbrengst 22 mg. Splitsing van 200 µL van deze preparatie gedurende de nacht met 20 units trombine resulteerde in bijna 100% splitsing van het fusie-eiwit.

De gebruikte hoeveelheid trombine is laag genoeg om niet detecteerbaar te zijn met kumasi. Blauwe kleuring en het verwijderen van de trombine en GST resulteerden in enig verlies van materiaal. Desalniettemin was het product meer dan 90% zuiver, met een opbrengst in deze preparatie van 70 µg A ICD bij een concentratie van 0,35 mg/mL.

AICD-aggregaten, gevisualiseerd met een AFM, zijn doorgaans steroid-amorf en variëren in grootte van 50 tot 100 nanometer. Geaggregeerd materiaal is niet detecteerbaar wanneer een equimolaire hoeveelheid van het chaperone UBI Quillin 1 wordt toegevoegd aan de aggregatiereactie. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u EICD zuivert, de aggregatie ervan induceert en aggregaten visualiseert via AFM-EICD.

Met deze techniek gezuiverde monsters kunnen worden toegepast in andere methoden, zoals lichtverstrooiings- en filtertrap-assays, om vragen te beantwoorden over het effect van moleculaire chaperonnes op de aggregatie van EACD.