Heterotypische Driedimensionale

Het algemene doel van het volgende experiment is om driedimensionale typische modellen van de vroege stadia van eierstokkankerontwikkeling te genereren. Eerst worden H turt geïmmortaliseerde cellijnen gegenereerd, afgeleid van primaire, normale ovariële epitheliale en fibroblastweefsels. Om vervolgens de in vivo architectuur en complexe cel-celinteracties in de eierstok na te bootsen, worden epitheliale en stromale cellijnen in driedimensionale S-sferoïde modellen gecultiveerd. Vervolgens worden de organoïde culturen gefixeerd en gekleurd om de expressie van specifieke markers te analyseren, teneinde de moleculaire kenmerken van stromale-epitheliale interacties te bestuderen.

De verkregen resultaten laten zien hoe wijzigingen in het stromale celcompartiment van 3D-typische modellen het fenotype van gecocultureerde epitheliale cellen kunnen beïnvloeden. Driedimensionale typische modellen kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het onderzoek naar eierstokkanker, zoals het verkennen van de oorsprong van deze ziekte en het verduidelijken van de rol van de stromale micro-omgeving bij het ontstaan en de ontwikkeling van tumoren. De toepassingen van deze technieken reiken verder tot ziektebehandeling en diagnose in vergelijking met andere 3D-kweektmethoden.

Deze techniek kan worden toegepast op een breder scala aan celcultuurvolumes en downstream-applicaties. Bijvoorbeeld kunnen 3D homo- en typische culturen worden gebruikt voor in vitro drugtesting. Deze benadering kan ook worden toegepast op andere modelsystemen, zoals bij de studie van andere typen solide tumoren of bij goedaardige ziekten.

Transporteer het verse eierstokweefsel naar het celkweeklaboratorium in groeimedium voor geïmmortaliseerde normale eierstokfibroblasten, aangevuld met extra antibiotica en antifungici. Was het monster drie keer met vijf milliliter PBS om eventuele epitheelcellen die nog los aan het weefsel vastzitten te verwijderen. Breng vervolgens het monster samen met de PBS over naar een schone P 100 kweekschaal. Verplaats het weefsel met steriele instrumenten naar een tweede droge, schone P 100 kweekschaal.

Snijd het weefsel in stukjes van 0,5 vierkante centimeter en breng elk stukje over naar een aparte P 100-schaal. Snijd het weefsel verder in stukjes kleiner dan één vierkante millimeter. Voeg vervolgens 20 milliliters INOF GM-medium toe en kweek het weefsel. Controleer de celgroei met fasencontrastmicroscopie.

Bevestig dat de cellen binnen 24 uur aan de schaal hechten. Controleer de celgroei met fasiscontrastmicroscopie. Cellen hechten gewoonlijk binnen 24 uur aan de schaal. Verwijder na een week elk niet-adherent weefsel door aspiratie, vul het medium aan en voed de culturen daarna twee keer per week gedurende één tot drie weken, wanneer de celkolonies ongeveer 500 microns groot zijn.

Isoleer de klonen met behulp van trips en gecoate kloneerschijfjes. Om te bevestigen dat het om 100% fibroblastische cellen gaat, plaatst u een monster van de cellijn op glazen dekglasjes en voert u een immunofluorescentiekleuring uit voor een fibroblastische marker, een epitheliale marker en een endotheelcelmarker.

Eén dag vóór de retrovirale transductie van H Turt passage worden de normale ovariale fibroblasten-celisolaten van één P 100 kweekschaal overgebracht naar drie P 100 kweekschalen. Vooraf geprepareerd viraal supernatant kan worden gekocht of in-house worden geproduceerd met behulp van standaardprotocollen voor cotransfectie van HEC 2 9 3 T-cellen. Om de polyhema-oplossing te bereiden, weegt u 1,5 gram polyhema af en plaatst u dit in een steriele fles.

Voeg 95 milliliters absoluut ethanol van moleculaire biologie-kwaliteit en vijf milliliters gedestilleerd water van celkweek-kwaliteit toe. Plaats de poly Hema-oplossing in een waterbad bij 65 °C totdat deze volledig is opgelost. Coat de weefkweekschalen met de vers gemaakte poly Hema-oplossing.

Laat de celkweekschaaltjes aan de lucht drogen in de laminaire flowkast. Licht schudden op een schudplatform kan worden gebruikt om een gelijkmatige coating van grotere schaaltjes of kolfjes te waarborgen. Als de polyus-oplossing te snel droogt, zal het oppervlak niet glad zijn.

Indien gewenst, kunnen de fibroblasten voorafgaand aan de 3D-cultuur worden voorbehandeld; voor de inductie van senescentie kunnen de cellen bijvoorbeeld worden voorbehandeld met subletale doses waterstofperoxide. Herstel en breid de INOF- en epitheelcelculturen in vitro uit om voldoende cellen te verkrijgen voor het opzetten van 3D heterotope organoïden. Voeg na een vijf minuten durende wasbeurt met PBS 15 milliliters medium toe aan de poly-HEMA-plaat.

Voeg ondertussen trypsine toe aan de geïmortaliseerde normale ovariale fibroblastcellen om ze los te maken van de kweekschaal. Neutraliseer na drie tot vijf minuten de trypsine met een gelijk volume kweekmedium en oogst de cellen door middel van centrifugatie. Resuspendeer de celpellet in vijf milliliter medium en meng dit goed door het monster herhaaldelijk met een pipetteer-beweging op en neer te bewegen of voorzichtig te vortexen.

Gebruik vervolgens een monster van 10 µL om de levensvatbare cellen te tellen met behulp van trypanblauw. Voeg nu 4 miljoen INOF-cellen toe aan het medium dat reeds in de poly-HEMA-gecoate plaat is gedispergeerd. Vul het volume van het kweekmedium aan tot 20 mL en incubeer bij 37 °C, 5% CO2.

Volg de cellulaire aggregatie tot multicellular steroiden via fascontrastmicroscopie om de S-sferoïdculturen elke twee tot drie dagen opnieuw te voeden. Plaats de platen schuin tegen een pipet aan. Laat de sferoïden bezinken en verwijder voorzichtig ongeveer 16 milliliters van het gebruikte medium met een vijf milliliter pipet.

Voeg 16 milliliters vers medium toe aan de cultuur en plaats deze op dag zeven terug in de incubator. Creëer heterotypische culturen door epitheelcellen toe te voegen aan de fibroblasten phe. Bereid eerst suspensies van ovariumepitheelcellen voor met trypsine zoals eerder beschreven, nadat de cellen zijn geteld.

Was één keer in INOF GM-medium om te voorkomen dat er groeifactoren uit de epitheliale groeimedia worden meegenomen. Voeg, na het aanvullen van het medium van de fibroblast-OID-culturen, de epitheliale cellen toe in een verhouding van vier fibroblasten op één epitheliale celcultuur. De heterotope OID's in INOF GM worden typisch elke twee tot drie dagen ververst gedurende nog eens 14 dagen.

Fixeer voor immunohistochemie het PHE met neutraal gebufferde formaline, pelletHet PHE en vervang de formaline door 70% ethanol. Ga verder met het inbedden in paraffine volgens standaardprotocollen voor menselijke weefsels. In paraffine ingebedde steroïden kunnen worden gesneden en gekleurd met H&E of specifieke moleculaire markers middels immunohistochemie.

Als alternatief kunnen de steroiden worden gewassen in PBS en gefixeerd in 4% paraformaldehyde. Bedden de monsters vervolgens in OCT-medium en vries ze snel in voor cryostat-sectie en immunofluorescentiekleuring voor analyse via flowcytometrie. Was de steroiden in PBS enstelt ze door trypsinering of digestie met Accutane bij 37 °C.

Volledige dissociatie van steroïden tot een enkelcellige suspensie kan worden bevorderd door de oplossing met een pipetteertip van één milliliter op en neer te pipetteren. Let erop dat de cellen niet te veel worden belast. Neutraliseer de reactie met een gelijk volume kweekmedium en verwijder celaggregaten door de suspensie door een cellzeef van 40 tot 70 micron te leiden. Pellet vervolgens de cellen, was deze met PBS en tel ze. Resuspendeer het gewenste aantal cellen in facts-buffer en kleur deze volgens de instructies van de fabrikant. In ons laboratorium hebben we gedeeltelijk getransformeerde epitheliale eierstokcellen gebruikt en deze gecultiveerd samen met normale en senescente eierstokfibroblasten om de vroege stadia van de ontwikkeling van eierstokkanker na te bootsen.

Bij een premenopauzaal eierstokreservoir laat immunofluorescentiekleuring van h hert geïmmortaliseerde normale ovariale fibroblasten zien dat zowel primaire normale ovariale fibroblasten als geïmmortaliseerde normale ovariale fibroblasten fibroblast-specifiek eiwit tot expressie brengen, maar ze brengen geen cytokeratine zeven tot expressie en brengen menton tot expressie. Normale ovariale fibroblastcellen die alleen in 3D-vorm PHE zijn gekweekt, vertonen een spoelvormige morfologie en een overvloedige extracellulaire matrix. Hier werden normale ovariale fibroblasten gedurende zeven dagen blootgesteld aan waterstofperoxide om senescentie op te wekken, waarna ze gedurende 14 dagen samen met gedeeltelijk getransformeerde ovariale epitheelcellen werden gekweekt.

Om de twee celtypen te onderscheiden, werden de resulterende sferoïden immunologisch gekleurd voor mim one als proliferatiemarker en pan-cytokeratine als epitheliale marker. Kwantificering van de gegevens suggereert dat de verouderende micro-omgeving neoplastische kenmerken van gedeeltelijk getransformeerde epitheliale cellen bevordert, terwijl een normale micro-omgeving neoplastische progressie remt; histologische kenmerken van normale en maligne cellen, die niet detecteerbaar zijn wanneer de cellen als monolagen worden gekweekt, worden hersteld. Wanneer de cellen worden overgezet naar een sferoïde-cultuur, kunnen bijvoorbeeld histologische kenmerken van heldercellige eierstokkanker worden gedetecteerd in 3D-culturen van heldercellige eierstokkanker-cellijnen, maar niet in monolayer-culturen van dezelfde cellen.

Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van het opzetten van driedimensionale typische culturen om de interacties tussen epitheelcellen en stromale cellen tijdens de vroege tumorigenese te bestuderen. Bij het opzetten van een 3D-cultuur is het belangrijk om de celaantallen aan te passen aan de daaropvolgende applicatie, rekening houdend met enig verlies van materiaal tijdens de verwerking.

Zodra de methode onder de knie is, kunnen 3D-culturen volgens deze procedure in één uur worden opgezet. Andere methoden, zoals flowcytometrie in combinatie met gene expression microarray-profilering, kunnen worden uitgevoerd om de globale veranderingen in genexpressie te analyseren die optreden in typische 3D-culturen, maar niet worden gedetecteerd onder monolayer-kweekcondities. Dit maakt het mogelijk om de bidirectionele signaleringspaden te ontleden die specifiek optreden binnen een 3D-kerncultuurmicro-omgeving.