MAME Modellen voor 4D live-cell imaging van de tumor: micro-omgeving interacties die van invloed zijn Maligne Progression

Het algemene doel van deze procedure is het bouwen van 3D co-cultuurmodellen, aangeduid als mammary architecture and microenvironment engineering, of MAM, voor gebruik bij live-cell imaging van cel-celinteracties in realtime. Dit wordt bereikt door eerst dekglasplaatjes te coaten met een fibroblast D quenched, of DQ collagen one, collageen one-matrix.

Vervolgens werd DQ-gequenched collageen I gebruikt. In de vierde stap wordt een gereconstitueerde basaalmembraanmatrix bovenop het gestolde DQ-collageen I geplaatst, de collageen I-matrix met ingebedde fibroblasten. In de derde stap wordt een suspensie van epitheel- of tumorcellen bovenop de dekglasjes aangebracht, zodat de cellen kunnen hechten aan het DQ-collageen I en de gereconstitueerde basaalmembraanmatrix, waarna medium wordt toegevoegd.

Ten slotte wordt confocale microscopie gebruikt om 4D-beeldvorming uit te voeren, waarbij een beeld in drie ruimtelijke dimensies plus de tijd van de levende mam-coculturen wordt geanalyseerd. Uiteindelijk maakt 4D-beeldvorming de visualisatie en analyse mogelijk van de dynamische interactie tussen borsttumorgestellen en andere cellen van de tumoromgeving die van invloed kunnen zijn op de progressie naar een invasief fenotype. Een belangrijk voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals intravitale beeldvorming, is dat de interacties die in ons model worden waargenomen plaatsvinden tussen cellen van één soort — namelijk menselijke tumorcellen en menselijke tumor-geassocieerde cellen — in plaats van, bijvoorbeeld, tussen menselijke tumorcellen en muisstromale cellen.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de assemblage van de belangrijkste kernculturen eerst gevisualiseerd moet worden en vervolgens gemiddelde vaardigheden en oefening vereist voor een succesvol resultaat. Begin met het plaatsen van één met alcohol gesteriliseerde rechthoekige plastic afdekking. Schuif deze in een 35 millimeter cultuurschaaltje of gebruik een IBI tree, 35 millimeter mu schaaltje.

Meng vervolgens het gewenste aantal fibroblasten met DQ-collageen. Pipetteer daarna met een micropipet van 100 µL voorzichtig 70 µL fibroblast-DQ-collageen, één collageen-één matrix, over het gehele oppervlak van het dekglas en plaats de kweekschaal gedurende 30 minuten in de bevochtigde incubator van 37 °C zonder kooldioxide. Nadat de matrices zijn gestold, laat u deze 10 minuten equilibreren in een incubator van 37 °C met 5% kooldioxide.

Plaats de schaal vervolgens onder een zuurkast tot deze op kamertemperatuur is. Voeg 60 µL DQ-collageen, vier gereconstitueerde basaalmembraanmatrix toe bovenop het gestolde DQ-collageen, één collageen one-matrix met ingebedde fibroblasten. Verspreid vervolgens met een pipetpunt de DQ-collageen vier gereconstitueerde basaalmembraanmatrix voorzichtig en gelijkmatig, waarbij krassen in de fibroblasten DQ-collageen one, collageen one-matrix worden vermeden.

Breng de schaal en het dekglas vervolgens 10 minuten over naar de incubator van 37 °C met 5% carbon dioxide, terwijl de DQ collagen four gereconstitueerde basaalmembraanmatrix stolt; trypsiniseer de ogen en tel de cellen voor de co-cultuur. Plaats nu 50 µL van de celsuspensie op het gecoate dekglas en plaats de schaal gedurende 40 tot 60 minuten in een incubator van 37 °C met 5% carbon dioxide om de cellen aan de DQ collagen four gereconstitueerde basaalmembraanmatrix te laten hechten. Nadat de cellen aan de matrix zijn gehecht, voegt u 2 mL cultuurmedium met 2% gereconstitueerde basaalmembraan toe aan de 35 mm schaal.

Incubeer vervolgens gedurende de gewenste periode voor beeldvorming na het wassen met PBS; incubeer de coculturen met 5 µM CellTracker Orange in MEGM-medium in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 45 minuten. Was de coculturen na de incubatie opnieuw met PBS en incubeer ze gedurende 30 minuten met voorverwarmd MEGM-medium in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. Beeldvorm de levende coculturen bij lage vergroting, bijvoorbeeld bij 10x met een water-immersielens op een confocale microscoop, en leg optische secties vast met intervallen van 10 µm over de gehele diepte van de structuren.

Gebruik de optische doorsneden om de beelden in 3D te reconstrueren met velocity-software of een soortgelijk programma. Maak films van de 3D-reconstructies zodat de structuren, cel-celinteracties en interacties met de omringende matrix gevisualiseerd kunnen worden. In dit representatieve schema van een maim co-cultuur werd een IBI-behandelde mu-schaal eerst gecoat met collageen, één bevattend DQ-collageen, één met fibroblasten, zoals hier in magenta te zien is.

Vervolgens werd een tweede laag gereconstitueerd basaalmembraan met DQ collageen four toegevoegd. Daarna werden tumorcellen in het rood uitgeplaat op een laag van 2% gereconstitueerd basaalmembraan in cultuur.

Media, weergegeven door de crèmekleurige stippen, werd toegevoegd bij elke mediumverversing. De fluorescerende splitsingsproducten van DQ collageen één en vier zijn in het groen weergegeven. Gedurende de 23 dagen van deze representatieve MCF 10 DCIS- en WS 12 TI-cocultuur was er proliferatie van de cellen (rood), zoals hier en in de volgende figuren afgebeeld, evenals degradatie van DQ collageen vier en één (groen), zoals hier en in de volgende figuren afgebeeld, en van collageenmatrices, zoals aangegeven door de afname in volume van de coculturen.

Dezelfde levende co-culturen werden gedurende 23 dagen geobserveerd, waarbij beelden werden vastgelegd met confocale microscopie op dag 3, 16 en 23 van de co-cultuur. De interacties in de Mame co-culturen zijn dynamisch en kunnen in de loop van de tijd veranderen. Zo is in dit 3D-model van de cel-mam co-cultuur op dag 3 te zien dat de cellen op dit moment net beginnen te prolifereren in de matrices; ze zijn nog vrij stabiel, wat blijkt uit de afwezigheid van groene fluorescentie.

Tegen dag 16 hebben de cellen, terwijl ze bleven prolifereren, echter ook de matrixstructuur begonnen af te breken, zoals hier waargenomen is via het DQ collagen, waarbij de splitsingsproducten één en vier in het groen zichtbaar zijn, en de actieve afbraak van de matrix door de cellen waarbij de matrix en de cellen samen fluoresceren, wat zichtbaar is in het geel. Tegen dag 23 is bijna de helft van de matrix afgebroken door de snel prolifererende cellen in vergelijking met dag drie, toen het volume van de co-cultuur 110.000 cubic micrometers was. Tussen dag 16 en 23 is het volume op deze dag gereduceerd tot slechts 46.250 cubic micrometers.

In de co-cultuur kan de proteolyse van DQ-collageen four aan het oppervlak van de DCIS-cellen in rood, en de diffuse proteolyse van DQ-collageen one in gebieden nabij de fibroblasten in wit worden waargenomen. De differentiële kleuring die in deze co-cultuur wordt gebruikt, maakt het ook mogelijk om de afzonderlijke migratie- en proliferatiepatronen van de twee celtypen na hun ontwikkeling te observeren. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van borstkanker om de effecten van de tumor-macromilieu op de progressie van kanker te verkennen, door gebruik te maken van live-cell imaging van dynamische interacties tussen kankercellen en omringende stromacellen.