Meting van antilichaam Effecten op cellulaire functie van geïsoleerde cardiomyocyten

Het algemene doel van het volgende experiment is het detecteren van cardiotrope antilichamen in het plasma van patiënten met gedilateerde cardiomyopathie of andere hartaandoeningen met een auto-immuunachtergrond. Dit wordt bereikt door een initiële mini-immunoabsorptie van patiëntenplasma op anti-IgG spheros-kolommen om in een tweede stap immunoglobuline G te zuiveren. Ventriculaire cardiomyocyten worden geïsoleerd uit volwassen Wistar-ratten, wat de cellulaire basis vormt voor deze bioassay.

Vervolgens krijgen de cardiomyocyten de tijd om aan de dekglasjes van de kamer te hechten en worden ze gekleurd met URA 2:00 AM om de observatie van intracellulaire calciumtransiënten tijdens contracties mogelijk te maken, waarna het IgG van de patiënt wordt getest om het effect op de contractiliteit van de cardiomyocyten te observeren. De resultaten tonen aan of het IgG van een patiënt tropische antilichamen bevat op basis van de veranderingen in contractiliteit en calciumtransiënten in de geïsoleerde cardiomyocyten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals standaard immunoassays voor de detectie van antilichamen, is dat deze onafhankelijk is van een specifiek antigeen en dat het mogelijk maakt om onderscheid te maken tussen stimulerende en blokerende antilichamen.

De procedure wordt gedemonstreerd door Google en technische ondersteuning wordt geboden vanuit ons laboratorium. Om deze procedure te starten, bereidt u de mini-immuno-absorptiekolommen voor door drie milliliter anti-IgG-spheres per twee milliliter EDTA-plasma van de patiënt in een lege econopak-kolom te vullen. Plaats vervolgens een filter bovenop de anti-IgG-spheres.

Snijd de onderste punt van de kolom open en druk op het filter om een stroomsnelheid van ongeveer één druppel per seconde te bereiken. Was de kolom vervolgens drie keer met één plasmavolume 0,9% natriumchloride. Pipetteer het plasma in de kolom; wanneer het plasma volledig in de anti-IgG Spheros is ondergedompeld, wordt er gewassen met hetzelfde volume 0,9% natriumchloride. Pipetteer daarna één plasmavolume 0,2 molair glycinehydrochloride bij pH 2,8 in de kolom en laat dit in de bolletjes trekken.

Voeg vervolgens nog een volume glycinehydrochloride toe aan de kolom. Verzamel de doorloop in een buis van 15 milliliter en stel de pH bij naar 7,3 met 0,5 molair trishydrochloride bij pH 8,0 om de kolom te regenereren. Was de kolom met drie plasmavolumes glycinehydrochloride, gevolgd door een laatste wasbeurt met twee volumes 0,9% natriumchloride.

De kolom kan worden gebruikt voor het volgende plasmamonster voor gebruik op cardiomyocyten. De verzamelde IgG-fractie moet worden gedialyseerd tegen experimentele buffer door de IgG-fractie eerst over te brengen naar een cellulose-ester dialysemembraanbuis met een molecular weight cutoff van 100 kilodaltons. Plaats de buis vervolgens in één liter EB en roer langzaam met een magnetroerder bij vier graden Celsius. Na acht uur wordt de dialysebuis overgeplaatst naar drie liter verse EB en nogmaals 20 uur gedialyseerd bij vier graden Celsius.

Kook het monster gedurende 30 minuten bij 57 °C in een waterbad. Bepaal de totale IgG-concentratie en bereid aliquoten voor die elk 330 µg IgG bevatten om de complementfactoren te inactiveren. Bereid bij deze procedure een calciumvrije isolatiebuffer volgens het bijbehorende manuscript.

Vul vervolgens 80 milliliter IB in het bovenste reservoir van een thermostat lanor perfusiesysteem en houd de buffer op 37 graden Celsius en belucht deze gedurende 30 minuten met 95% oxygen, 5% carbon dioxide. Los ongeveer 7.000 tot 10.000 units collagenase type twee en 174 milligram vetzuurvrij BSA op in 20 milliliter IB met 112,5 micromolar calciumchloride en pas indien nodig de pH van de isolatiebuffer in het bovenste reservoir aan.

Anestheseer vervolgens een Wistar-rat van 175 tot 200 gram met thiopental in een dosis van 375 µg/kg, waarbij 2.500 IU heparine aan de thiopentaloplossing is toegevoegd. Na thoracotomie wordt het hart voorzichtig uitgesneden met een intacte aortaboog en overgebracht naar ijskoud 0,0% natriumchloride in ijskoud natriumchloride. Verwijder het bloed en het omliggende weefsel van het hart.

Breng het vervolgens over naar vers 0,9% natriumchloride en leg de aorta vrij. Zet de flow-reducer van het langor-systeem aan om een dripsnelheid van twee tot drie druppels per seconde te verkrijgen. Bevestig vervolgens het hart aan de canule.

Perfundeer het gedurende maximaal drie minuten met een stroomsnelheid van één druppel per seconde om het resterende bloed uit te spoelen. Laat daarna het IB circuleren in het LOR-systeem. Verwijder nu 20 milliliters buffer uit het bovenste reservoir.

Vul het reservoir met de collagenase-oplossing en vul aan met zoveel buffer als nodig is om een volume van 80 milliliters te bereiken. Laat de digestie-oplossing vervolgens nog 27 minuten circuleren. Koppel daarna het hart los van de canule.

Verwijder de atria en de aorta, en snijd vervolgens de ventrikels in kleine stukjes. Laat de digestiebuffer in het onderste reservoir lopen. Verminder het volume tot maximaal 40 milliliters om de gesneden ventrikels gedurende 10 tot 15 minuten verder te verteren onder continue beluchting met 95%oxygen, 5%carbon dioxide.

Filter daarna de celsuspensie door een gaas met een maaswijdte van 200 micron in een buis van 50 milliliter. Herstel tot slot het calciumgehalte van de cellen door de celsuspensie twee minuten lang te centrifugeren bij 40 3G. Resuspendeer de cellen bij kamertemperatuur in 10 milliliter.

Centrifugeer het IB dat 200 micromolaire calciumchloride bevat opnieuw en resuspendeer de cellen in 10 milliliter IB met 500 micromolaire calciumchloride. Na een laatste centrifugatie worden de cardiomyocyten geresuspendeerd in steriel gefilterd EB tot een dichtheid van 50.000 cellen per milliliter.

Coat de dekglasjes in een kamer met vier putjes met 10 micrograms laminine per putje en wacht tot dit volledig is opgedroogd. Vul vervolgens elk putje met één milliliter van de cardiomyocytensuspensie. Gebruik een micropipet met een afgesneden tip en laat de cellen gedurende één uur bij kamertemperatuur hechten; verdun 10 microliters van de één milligram per milliliter fira 2:00 AM-stamsoplossing in vijf milliliters eb en bewaar de kleuringsoplossing in het donker.

Verwijder vervolgens de buffer en de niet-gehechte cellen van de dekglasjes en pipetteer 0,5 milliliters van de kleuringsoplossing in elke put. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten onder matige schudding. Verwijder daarna de kleuringsoplossing en was de cellen eenmaal met één milliliter eb.

Voeg vervolgens in deze procedure 0,5 milliliters EB toe aan elke put en plaats het dekglas onder een inverted fluorescentiemicroscoop die is verbonden met een systeem voor het registreren van calcium en contractiliteit van myocyten. Plaats een op maat gemaakte elektrode met een inlaat- en uitlaatbuis in de eerste put en spoel de cardiomyocyten met één milliliter per minuut eb.

Start de elektrische stimulatie bij 20 volt, één hertz en een pulsduur van vijf milliseconden, en laat de cellen ongeveer twee minuten wennen aan de stimulatie. Kies een intact staafvormige cardiomyocyt met duidelijke striaties en een constante contractie en positioneer deze in het centrum van het gezichtsveld. Open vervolgens het camerakanaal en oriënteer de cel horizontaal binnen het videogebied door de adapter voor celkadering te draaien en de microscooptafel te verschuiven.

Pas de begrenzing van de detectiecontrole-elementen van het videogebied aan. Schakel het fluorescentiekanaal in en registreer 10 tot 15 contracties om de initiële celverkorting en calciumtransient te verkrijgen. Schakel daarna het lichtkanaal van de microscoop uit om bleking van de fluorescerende kleurstof te voorkomen.

Schakel de doorstroming met een driewegkraan om van EB naar de monsterbypass en perfuseer de cardiomyocyten met één milliliter patiënt-IgG. Stop de pomp net voordat de lucht de put bereikt, schakel vervolgens het lichtkanaal in en registreer nog eens 10 tot 15 contracties om de acute celrespons vast te leggen. Pauzeer daarna de registratie en schakel het lichtkanaal opnieuw uit, herhaal de registraties na twee en vijf minuten en verwijder de elektrode uit de put wanneer deze zijn voltooid. Analyseer aan het einde de celverkorting en de calciumtransiënt met de IonWizard-software, gebruikmakend van respectievelijk het edge length/length-venster en het URA two numeric subtracted/ratio-venster.

Bereken vervolgens de procentuele veranderingen voor de acute respons, de respons na twee minuten en de respons na vijf minuten ten opzichte van de initiële celverkorting en de piekhoogte van de calciumtransiënt. Hier is een representatief voorbeeld van de controlemeting. Celverkorting en de calciumtransiënt werden online gemonitord vóór de superfusie met IgG en direct twee en vijf minuten na de superfusie met IgG.

En hier is een voorbeeld van de meting van een IgG-monster dat cardiodepressieve antilichamen bevat. De celverkorting en de calciumtransiënt werden online gemeten vóór de superfusie met IgG en direct twee minuten en vijf minuten na de superfusie met IgG. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u cardio-toxische antilichamen in patiëntenplasma kunt detecteren door het effect van geïsoleerd IgG op de celverkorting en de calciumtransiënt van geïsoleerde volwassen rode cardiomyocyten te meten.