High Throughput Sequentiële ELISA voor de validatie van biomarkers van acute graft-versus-Host ziekte

Het algemene doel van het volgende experiment is om gebruik te maken van high-throughput sequentiële ELISA om efficiënt een groot aantal nieuwe biomarkers te analyseren die via proteomics zijn ontdekt. Dit wordt bereikt door eerst monsters toe te voegen aan een bronplaat, die wordt gebruikt om verdunningen voor elke biomarker te maken en om herwonnen plasma tussen de tests door te bewaren. Vervolgens worden er ELISA's uitgevoerd voor elk eiwit om hun concentraties in patiëntenmonsters te bepalen.

Uiteindelijk kan de verhoging van de proteïneniveaus van deze biomarkers bij het begin van de klinische manifestaties van acute graft-versus-hostziekte worden beoordeeld. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat sequentiële analyzers meerdere nieuwe proteïnen kunnen analyseren die niet altijd beschikbaar zijn via multiplex-platforms. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose van acute graft-versus-hostziekte.

Aangezien biomarkers die via deze methode zijn gevalideerd nu worden onderzocht voor de klinische zorg, kan deze methode inzicht bieden in complicaties bij poëtische stamceltransplantatie na een trauma. Daarnaast kan de methode worden toegepast voor de ontdekking en validatie van biomarkers voor andere aandoeningen, zoals complicaties bij longtransplantaties, longkanker of potentieel elke ziekte waarbij een diagnostische bloedtest nuttig zou zijn.

Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het belangrijk is dat de verschillende stappen consistent worden uitgevoerd om reproduceerbaarheid te waarborgen en batchvariabiliteit te minimaliseren. Centrifugeer de dag vóór het experiment de plasma-aliquotmonsters gedurende 10 minuten bij 15.300 RCF en 4 °C om de stolsels aan de bodem en de lipiden aan de bovenkant van het plasma te scheiden. Pipetteer vervolgens handmatig 150 µL onverdund plasma van elk monster op een 96-well V-bodemplaat volgens vooraf gedefinieerde schema's. Wikkel de plaat in Parafilm en plaats deze in een koelkamer bij 4 °C voor maximaal 72 uur.

Reconstitueer en verdun vervolgens de IL twee receptor alfa en de menselijke groeifactor, of HGF capture-antilichamen volgens de specificaties van de fabrikant, en breng aliquots van 50 µL van elk antilichaam aan in elke put van de respectievelijke 96-well high-binding halfwell-plates. Seal deze plates vervolgens met een plate sealer en incubeer ze overnight bij 4 °C. Verdun nu reg drie alpha met de coatingbuffer van de fabrikant volgens het protocol van de fabrikant en breng 25 µL van de oplossing aan in elke put van een 3 84-well no maxor plate.

Bewaar deze plaat vervolgens ook op de eerste dag van het experiment verzegeld bij vier graden Celsius. Begin met het wassen van de IL two receptor alpha testplaat en het blokkeren ervan met blotto in TBS. Stel, na het reconstitueren van de standaard, een standaardcurve met acht punten op volgens het protocol van de fabrikant.

Breng voor de volgende plaat 50 µL onverdund plasma en 50 µL van elke standaard in dubbeltoets van de bronplaat over naar de ELISA-testplaat. Incubeer vervolgens de afgesloten plaat bij kamertemperatuur op een platenrotator ingesteld op 300 RPM. Haal na twee uur het plasma uit de IL-2 receptor alfa ELISA-testplaat en plaats het terug in de bronplaat met onverdund plasma.

Lees vervolgens, na voltooiing van de EIA volgens het protocol van de fabrikant, de optische dichtheid van elke well af met een platlezer ingesteld op 450 tot 570 nanometer. Voor de Reg IIIα ELISA wordt eerst 10 µL onverdund plasma overgebracht naar een aparte V-bodem bronplaat, waarna 90 µL van de door de fabrikant geleverde verdunningsbuffer aan elke well wordt toegevoegd om een 1:10 verdunningsbronplaat te maken. Na voltooiing van de Reg IIIα ELISA, conform het protocol van de fabrikant, wordt de stopoplossing aan de 384-well plaat toegevoegd en de optische dichtheid van elke well afgelezen met een platlezer ingesteld op 450 tot 620 nanometer. Na het reconstitueren en verdunnen van de elephant en TNF-R1 capture-antilichamen volgens de specificaties van de fabrikant, wordt elke well van de respectievelijke 96-well high-binding half-well platen gecoat met 50 µL van de capture-antilichamen.

Incubeer vervolgens de verzegelde testplaten een nacht bij kamertemperatuur voor de elephant-plaat en bij vier graden Celsius voor de TN FFR one-plaat. Breng na voltooiing van de IL twee receptor alpha Eliza 60 µL onverdund plasma over naar een nieuwe bronplaat. Voeg vervolgens 60 µL 1%BSA in PBS toe aan elke put om een 1:2 verdunde plasmabronplaat te maken.

Was vervolgens de HGF-testplaat en blokkeer deze met BLOTTO in TBS, en stel daarna de verdunningsreeks op voor de standaardcurve met acht punten. Nadat de plaat is gewassen en de blokkeringsstap is voltooid, brengt u duplicaat-aliquots van 50 µL van de plasmaverdunningen (1:2) en van elke standaard aan op de EISA-testplaat. Incubeer de afgedichte plaat vervolgens gedurende de nacht bij kamertemperatuur op een plaatrotor die is ingesteld op 300 RPM.

Herstel de volgende ochtend het 1:2 verdunde plasma uit de HGF Eliza-testplaat en plaats dit terug in de bronplaat met het 1:2 verdunde plasma. Nadat de EIA volgens het protocol van de fabrikant is voltooid, wordt op de tweede dag van het experiment de optische dichtheid van elke put gemeten met een plaatlezer ingesteld op 450 tot 570 nanometer. Breng eerst 10 µL onverdund plasma over naar een nieuwe bronplaat, en voeg vervolgens 190 µL 1%BSA in PBS toe om 200 µL 1:20 verdund plasma te verkrijgen.

Nadat de ELISA volgens het protocol van de fabrikant was voltooid, las zij de optische dichtheid af met een platenlezer ingesteld op 450 tot 570 nanometers. Voor de TN FFR-analyse voegde zij eerst 25 microliters 1%BSA en PBS toe aan de 1:20 bronplaat, resulterend in 125 microliters 1:25 verdund plasma per well. Nadat de TN FFR EIA conform het protocol van de fabrikant was voltooid, las zij de optische dichtheid van elke well af met een platenlezer ingesteld op 450 tot 570 nanometers. Voor de I-L-H-E-I-A transferde zij eerst 60 microliters 1:2 verdund plasma naar een nieuwe bronplaat en voegde vervolgens 180 microliters IL eight verdunningsvloeistof toe aan elke well om een 1:6 verdunde plasmaplatenbron te maken.

Voer vervolgens de ILH-Elisa uit volgens het protocol van de fabrikant en lees de optische dichtheid van elke put af met een platenlezer ingesteld op 450 tot 570 nanometer. Wanneer alle ELISA's zijn voltooid, brengt u het ongebruikte plasma terug in de cryovials en vriest u deze in voor toekomstig gebruik. In deze grafiek worden de optische dichtheden voor de standaardcurve van zeven verschillende ELISA-platen getoond die de reg drie alpha-concentraties meten, overeenkomend met de 1084 patiënten die zijn getest voor het initiële reg drie alpha-biomarkerrapport voor gastro-intestinale graft-versus-hostziekte; consistente optische dichtheden tussen de platen waarborgen consistente eiwitconcentratiemetingen tussen de experimenten.

De concentraties van de eiwitten in de plasmaproeven werden berekend door de optische dichtheden van de monsters te vergelijken met de optische dichtheden van de standaardcurve. Een robotisch schoon handlingsplatform kan worden gebruikt om de reproduceerbaarheid verder te verhogen en tegelijkertijd het volume gebruikte plasma te verkleinen door gebruik te maken van ELISA- en creatieve vorm-wellplaten. Bij het plannen van deze procedure is het belangrijk om eerst de EIS'en met onverdund plasma uit te voeren, zodat dit na ontwikkeling kan worden teruggewonnen en gebruikt kan worden in latere experimenten.

Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de proteomica om kandidaat-biomarkers bij elke gewenste ziekte te onderzoeken door middel van het universele gebruik van sequentiële ELISA's. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe meerdere biomarkers gevalideerd kunnen worden met sequentiële E, waarbij kleine volumes plasma worden gebruikt en vrije cycli worden geminimaliseerd.