Twee-en drie-dimensionale live cell imaging van DNA schade respons Eiwitten

Deze demonstratie maakt gebruik van 2D- en 3D-live cell imaging om de spatiotemporele relaties van eiwitten die betrokken zijn bij de DNA-schaderespons te begrijpen. Transfecteer of transduceer eerst de door u gekozen cellijn met expressieconstructen die de juiste fluorescente markers bevatten; in dit geval M Cherry en GFP. Neem vervolgens een reeks controlevideo's op van de fluorescentie-gelabelde cellen onder normale omstandigheden.

Pas vervolgens een passende behandeling toe en verzamel gegevens over de effecten van de behandeling op het proces in de fluorescente cellen, en analyseer de videogegevens op ruimtelijk-temporele relaties tussen eiwitten. Uiteindelijk kan live-cell fluorescentiemicroscopie cellulaire dynamiek in detail blootleggen, zoals de vorming van 53 BP one-foci als reactie op DNA-beschadigende agentia of het gedrag van 53 BP one tijdens de mitose. Wij raakten aanvankelijk geïnteresseerd in 2D- en 3D-live-cell imaging toen we wilden bestuderen hoe verschillende behandelingen de mitose in bepaalde cellijnen beïnvloedden.

Deze experimentele aanpak stelt ons in staat om de DNA-schaderespons en het behoud van genomische stabiliteit gemakkelijker te bestuderen dan met traditionele methoden. Daarnaast kunt u deze methode gebruiken om te bestuderen hoe bepaalde eiwitten interageren in diverse signaleringspaden en verschillende cellijnen. Het belangrijkste voordeel van live-cell imaging ten opzichte van traditionele technieken zoals cytochemie is dat het de studie van DNA-schaderespons-eiwitten in realtime mogelijk maakt.

Het optimaliseren van de juiste opnamecondities kan uitdagend zijn. Deze demonstratie kan worden gebruikt om de vele kleine stappen te zien die nodig zijn om succes te garanderen. Onthoud dat volharding loont wanneer het gaat om het minimaliseren van fotobleken, het vinden van de juiste opname-intervallen en de juiste opnameduur, enzovoort.

Transfecteer of transduceer de geschikte cellijnen met de plasmiden voor de expressie van mCherry- en GFP-fusie-eiwitten. Houd de culturen in stand onder medicijnselectie en controleer periodiek op de expressie van de fluorescerende eiwitten op de dag vóór de beeldacquisitie. Oogst de cellen met behulp van trypsine.

Zaai vervolgens laag-densiteitsculturen uit op fluoro dish glazen bodemplaten van 3,5 centimeter. Dit protocol is ontwikkeld met gebruik van de Zeiss cell observer SD spinning disc confocale microscoop, uitgerust met een axio observer Z one statief. Controleer eerst of het CO2-gas naar de CO2-module van het incubatiesysteem stroomt. Indien de microscoop wordt ondersteund door een trillingsvrije Airtable, schakel dan de luchttoevoer voor de Airtable in.

Zet nu de stroom aan voor de microscoopstand, de spinning disc-eenheid, de camera's, de incubatiemodules, de HXP-illuminator, de gemotoriseerde tafel, de argonlaser en de computer. Zet de schakelaars in voor de laserlijnen die worden gebruikt. Start de Axio vision-software op.

De Avision-software kan worden aangepast met vensters en uitklapmenu's die specifiek zijn voor de microscoop en de componenten die deze aanstuurt. Hierdoor heeft elke gebruikersinterface een potentieel unieke weergave. Ongeveer één uur vóór het maken van beelden: zoek de bedieningselementen van de incubator en schakel de verwarming voor de bovenkamer en de objecttafelplaat in.

Stel de temperatuur in op 37 °C. Schakel de CO2-regeling in en stel het niveau in op 5%. Selecteer het objectief voor de beeldvorming in deze studie. Voor het objectief is een immersiemedium nodig met een brekingsindex die vergelijkbaar is met die van water.

Als u meerdere posities over langere tijd wilt afbeelden, zorg er dan voor dat u voldoende immersievloeistof aanbrengt, zodat de scoop niet uitdroogt. Plaats de kweekschaal op de tafel en breng de objectieflens in contact met de bodem, gebruikmakend van zowel de microscoopbediening als de software. Richt het uitgezonden licht naar de oculairs en selecteer de juiste breedveldfilterset voor het fluorescerende signaal waarin u geïnteresseerd bent.

Kijk nu door de oculaire lenzen. Stel het beeld scherp en zoek een geschikt celveld met behulp van de software of de bedieningselementen van de microscoop. Leid het uitgezonden licht via de software van de oculairs weg naar de poort met de confocale spinning disc unit.

Zet de juiste laser voor deze studie aan. Pas voor elk kanaal de intensiteit van de laser aan door de bediening van het kuo-optische instelbare filter naar een passend niveau te brengen. Selecteer vervolgens de juiste dichroïsche spiegel en emissiefilters.

Open de sluiter van de spinning disc-unit. Selecteer nu het live-venster om het huidige gezichtsveld weer te geven. Open nu het venster voor camerabediening.

Selecteer de te gebruiken camera en stel de belichtingstijd in op ongeveer 100 milliseconden. Pas het percentage en de EM-gain naar behoefte aan. Open daarnaast de bediening van de confocale spinning-disc-unit en stel de snelheid van de spinning-disc in door de ingestelde belichtingstijd van de camera in te voeren om een geschikt beeld vast te leggen.

Klik op 'set' om de wijziging te bevestigen. Open nu het venster voor multidimensionale acquisitie. Selecteer het tabblad 'channel' en laad of selecteer de passende kanalen die zijn gedefinieerd voor de Flora Fours.

Gebruik voor een correcte beeldregistratie een gemeenschappelijke dichroïsche spiegel voor beide kanalen. Stel de software in op autofocus. Ga naar het MDA-venster en klik op het tabblad ZS-stack.

Selecteer de ZS-stack op de huidige focuspositie. Stel het bereik in voor een Zack van 10 micron en kies de optimale waarde voor het aantal stappen om Nyquist-sampling door de Z-as te waarborgen. Klik nu op start en analyseer de resulterende Z-stack afbeelding. Selecteer het tabblad tijd.

Stel het interval tussen de beeldmaakmomenten en de totale duur van de sessie in. Voor multi-point imaging van meerdere cellen in de schaal opent u het MDA-venster. Selecteer het tabblad 'Position' en controleer of de optie 'apply setting before or after time point per position' is aangevinkt.

Selecteer nu 'mark'. Zoek via de liveweergave, verplaats de schaal en selecteer de juiste gezichtsvelden. Klik op 'start' in het menu voor multidimensionale acquisitie om het experiment te beginnen en een controlevideo op te nemen.

Voeg vervolgens de juiste behandeling toe en neem de experimentele video op met bepaalde tijdsintervallen gedurende een gedefinieerde periode. Voor deze cellijn en om het volledige proces van mitose te monitoren, gebruikten we een interval van zeven en een halve minuut gedurende vier tot vijf uur. U zult de specifieke instellingen voor uw eigen cellijn en voor datgene wat u wilt bestuderen moeten bepalen.

Open de Velocity-software, maak een nieuwe bibliotheek aan, geef deze een naam en importeer de experimentele videobestanden om deze te kunnen bekijken. Probeer de instelling voor uitgebreide focus (extended focus) en pas de video's naar behoefte aan. Velocity is uitgerust met diverse hulpmiddelen om de kwaliteit van de verkregen beelden te verbeteren.

Wanneer de instellingen van de microscoop correct zijn, bespaart dit later veel tijd bij het bewerken. Het is vaak nuttig om uw beelden te ontwikkelen en de helderheid en het contrast aan te passen; uw specifieke behoeften zullen variëren afhankelijk van uw experiment. Schakel over naar de instelling voor 3D-opaciteit om de cellen in 3D te bekijken.

Dit maakt het mogelijk om de in 3D gerenderde cellen in de ruimte te roteren, waardoor meerdere perspectieven van interessante structuren binnen de cellen kunnen worden verkregen. Films. Stilstaande beelden kunnen worden geëxporteerd naar diverse bestandstypen, afhankelijk van de voorkeur van de gebruiker. In vergelijking met de controles vormden fibroblastcellen die waren blootgesteld aan CPT binnen vijf tot 10 minuten foci, en behielden zij deze foci gedurende de gehele opnameperiode.

Interessant is dat 53 BP1 in menselijke embryonale niercellen bij het begin van de mitose loskomt van het chromatine, waardoor een dunne waas rond de condenserende chromosomen ontstaat. Wanneer telofase optreedt en de mitose ten einde loopt, aggregeert 53 BP1 opnieuw in duidelijke foci. We hopen dat deze video u in staat stelt om de spatiotemporele relaties van eiwitten die betrokken zijn bij de DNA-schaderespons en andere pathways te bestuderen.

Bijvoorbeeld, op het gebied van chromatinedynamiek is deze techniek gebruikt om te bestuderen hoe de binding van 53 BP1 de beweging van telomere uiteinden van DNA beïnvloedt. Na het creëren van genetisch gemodificeerde cellen kan er gedurende ongeveer vier tot acht uur 2D- en 3D-live cell imaging worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat de instellingen van de microscoop correct zijn aangepast voor een optimale beeldvorming.