Een visuele beschrijving van de dissectie van de Cerebral Surface vaatstelsel en de geassocieerde hersenvliezen en het Choroid Plexus van Rat Brain

Het algemene doel van deze procedure is om efficiënt en spoedig de peel- en arachnoïde delen van de meninges en de bijbehorende arteriële vaten, die over het oppervlak van de cortex van de voorhersenen en de middenhersenen, de thalamus en de calli liggen, te dissekeren, alsmede om de plexus choroidea uit de zijventrikels te oogsten. Dit wordt bereikt door eerst de pijnappelklier te verwijderen en de meninges en de arteriële bomen die aan de voorhersenen vastzitten te scheiden. Ten tweede worden de arteriën en arteriolen op het corticale oppervlak zorgvuldig verwijderd, beginnend bij de ventrale cirkel van Willis en vervolgens voortgaand naar de dorsale corticale oppervlakken, zodat de peel en de resterende arachnoïde membranen aan de vaten bevestigd blijven, waarbij erop wordt gelet dat het oogsten van aangrenzend cortical weefsel tot een minimum wordt beperkt.

Vervolgens worden de cortex en de commissurale vezels weggeprepareerd van het septum en de hippocampus, waardoor de laterale ventrikels worden blootgelegd om de plexus choroideus te kunnen oogsten. Ten slotte wordt de hippocampus verwijderd, waarbij de thalamus en de calli van de middenhersenen zichtbaar worden. De hersenvliezen en de bijbehorende vasculatuur boven dit gebied worden vervolgens gedissekeerd.

Uiteindelijk kan de integriteit en specificiteit van de gedisseceerde hersenvliezen en het bijbehorende arteriële vasculatuur, evenals de plexus choroideus, worden bepaald door de genexpressieprofielen van elk van deze regio's te vergelijken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in onderzoek naar het vasculair systeem dat de hersenfunctie ondersteunt. Dit omvat overeenkomsten, vergelijkingen en verschillen in de functie van de plexus choroideus ten opzichte van de hersenvliezen en de bijbehorende arteriële vasculatuur met betrekking tot de bloedstroom, de CSF-functie, neurotoxische insulten en hersentrauma.

Om dit protocol te starten, plaatst u hersenen die direct na euthanasie van ratten zijn verwijderd gedurende vijf minuten in ijskoud, normaal zoutoplossing. Het is belangrijk om de hersenen deze tijd te laten afkoelen vóór de dissectie, zodat de hersenvliezen en de bijbehorende arteriële vasculatuur (MAV) van het cortexoppervlak kunnen worden gescheiden. Plaats de hersenen vervolgens in de bodem van een glazen Petrischaal op ijs, met één centimeter ijskoud, normaal zoutoplossing of 0,1 M natriumfosfaatgebufferde zoutoplossing bij een pH van 7,4.

Alle dissectie dient te worden uitgevoerd terwijl de hersenen grotendeels in fysiologische zoutoplossing zijn ondergedompeld. Om te beginnen met de dissectie, wordt het brein met de dorsale zijde naar boven in de Petrischaal geplaatst; zoek vervolgens de pijnappelklier, die zich in het meest caudale ventrale gebied tussen de twee hemisferen bevindt. Deze bevindt zich net rostraal van het cerebellum en net onder, of aan het oppervlak van de meninges.

Over de colli. Verwijder de pijnappelklier met twee kleine gebogen pincetten. Let op dat de pijnappelklier roze van kleur is, net als de cortex, maar vaak omringd is door resten van residu bloed en vaten die zijn achtergebleven na het verwijderen van de hersenen.

Draai de hersenen vervolgens ondersteboven in de Petrischaal. Scheid daarna de arteria vertebralis, de kleinere arteriën en de hersenvliezen die de pons bedekken van de hersenvliezen en het vasculatuur van de voorhersenen. Begin vervolgens met het verwijderen van de MAV.

Het is belangrijk om bij het dissectieproces ventraal te beginnen met de belangrijkste slagaders van de cirkel van Willis: de middelste cerebrale arteriën en de voorste arteriën. Begin vervolgens bij een van de hemisferen en gebruik kleine pincetten met een gebogen punt om de arteria communicans posterior net posterieur aan de aansluiting met de arteria carotis interna door te snijden, waardoor de meer anterieure en posterieure arteriële bomen van de voorhersenen van elkaar worden gescheiden. Herhaal vervolgens hetzelfde proces voor de contralaterale hemisfeer.

Pak nu de MCA en de anterieure arterie met de pincet en trek voorzichtig in een anterieure dorsale richting, zodat de MAV die de ventrale anterieure cortex bedekt, over en rond de olfactory tract wordt getild. Hierdoor wordt een groot deel van de MAV die de anterieure cortex bedekt, verwijderd. Draai de hersenen in een hoek van 45 tot 90 graden ten opzichte van de Petrischaal, zodat de meer anterieure laterale regio's van de MAV rond de laterale corticale regio's van de cortex kunnen worden bevrijd; pak de MCA en de bijbehorende arteriën vast en trek voorzichtig dorsaal langs de cortex.

Indien nodig kunnen de uiteinden van de pincet worden gebruikt om de grote slagaders tijdens de dissectie op te tillen en los te maken van de cortex. Verwijder nu de meer posterieure laterale regio's van de MAV. Let op dat het raadzaam is om tijdens dit oogstproces tussen de twee hemisferen te wisselen om ervoor te zorgen dat de MAV koud en gehydrateerd blijft; wissel ook van hemisfeer als er weerstand wordt ondervonden bij het losmaken van de MAV van de cortex.

Ten slotte, om de meest dorsale regio's van de MAV rondom de primaire somatosensorische en motorische cortex te verwijderen, draait u de hersenen met de dorsale zijde naar boven om dit gedeelte los te maken van de hersenen; gebruik hiervoor de uiteinden van de pincet langs de sinus sagittalis. Dit deel van de geoogste MAV kan tijdelijk worden bewaard in ijskoud zout water tot het nodig is voor testen en analyse, of worden ingevroren voor latere verwerking. Vaak blijft de MAV die de meest posterieure caudale regio's van de cortex bedekt, vastzitten.

De verwijdering hiervan wordt getoond in een volgend gedeelte van deze video. Om de plexus choroidea te verwijderen, plaatst u de hersenen eerst met de dorsale zijde naar boven en houdt u deze op hun plaats met de grootste pincet. Duw vervolgens de kleinere pincet via de middellijn tussen de hemisferen naar beneden en gebruik de uiteinden om door de cortex en het corpus callosum in de bovenkant van de middellijn van de hippocampus te prikken.

Gebruik vervolgens de pincet om de cortex met het corpus callosum weg te trekken van de dorsale hippocampus en het septum, waardoor het grootste deel van het laterale ventrikel zichtbaar wordt. De plexus choroidea kan worden gelokaliseerd en geïdentificeerd aan de golvende rode lijn die de hoofdartiere markeert die over de gehele lengte loopt. Gebruik de twee uiteinden van de pincet om de laterale wanden van het derde ventrikel open te wrikken en dit aan het meest caudale uiteinde te vergroten.

Trek vervolgens met de kleine pincet dit uiteinde van de plexus choroidea vrij. Gebruik daarna de pincet om het uiterste anterieure gebied tussen het septum en de regio van het caudatus putamen te verbreden en trek ook aan dit uiteinde de plexus choroidea vrij. Voer dezelfde procedure uit op de contralaterale hemisfeer om de tweede overgebleven plexus choroidea te verkrijgen.

Vervolgens kan dit weefsel tijdelijk op ijs, gekoeld, in zoutoplossing of bevroren worden bewaard voor latere verwerking. Om de resterende MAV te verwijderen die de meest posterieure gebieden van de cortex bedekt, verwijdert u eerst de gehele hippocampus uit beide hemisferen, waardoor de MAV over de thalamus en colliculi bloot komt te liggen. Let op dat de verwijdering van dit deel van de MAV veel minder moeilijk zal zijn dan de verwijdering van de resterende MAV uit de cortex.

Door de grotere vaten boven het anterieure gedeelte van de thalamus vast te pakken en voorzichtig in de richting van de coddles te trekken, wordt duidelijk dat deze vaten verbonden zijn met het supra-cocurriculaire netwerk en bloed leveren aan de dorsale hippocampus en het dorsale thalamusnetwerk. Trek voorzichtig weg, waardoor het supra-netwerk uiteindelijk vrijkomt en de laatste delen van de arteriële coddle-cirkel bereikt kunnen worden. Op dit punt moet er extra zorgvuldig worden gewerkt om elke resterende AVM op het oppervlak van de granulaire retros lineale primaire, auditieve en visuele cortices te verwijderen.

Eventueel resterend posterieur ventraal corticaal MAV dat is geoogst met deze tweede thalamische en calli MAV-sectie, dient te worden verwijderd en toegevoegd aan de eerste gedissecteerde corticale MAV-sectie indien ze afzonderlijk moeten worden geanalyseerd. Vervolgens kan, om genexpressieprofielen tussen het striatum, de pariëtale cortex en MAV-regio's onder controlecondities te vergelijken, genexpressieanalyse worden uitgevoerd met behulp van Agilent 0 1 4 8 7 9 whole rat genome, four by 44, 060 mer oligonucleotide arrays. Verdere details over verwerking, scannen en initiële gegevensopslag zijn te vinden in Thomas et al.

Wanneer de dissectie correct is uitgevoerd, zouden de resulterende MAV-weefsels uit twee intacte entiteiten moeten bestaan met een totaal gewicht van ongeveer 35 tot 45 milligram. Het aanvankelijk gedissecteerde MAV dat het grootste deel van de cortex omringt, zou ongeveer 25 milligram moeten wegen, en het deel dat de thalamus, calli en occipitale cortex bedekt, zou ongeveer 15 milligram moeten wegen.

Het weefsel moet een lichtroze kleur hebben door het residuele bloed in de vasculatuur. De geoogste bilaterale plexus choroidea moet bestaan uit twee intacte weefselmonsters, die elk één tot twee milligram wegen, zoals hier te zien is. Hier zien we een vergelijking van genexpressieprofielen in het striatum, de pariëtale cortex en de MAV onder controlecondities.

De bovenste grafiek toont de expressie in het striatum vergeleken met de pariëtale cortex. Terwijl de onderste grafiek de expressie in de MAV toont vergeleken met de pariëtale cortex, is te zien dat het striatum en de pariëtale cortex veel nauwer aan elkaar verwanten zijn dan de MAV. Hier zien we de differentiële genexpressie in de MAV als reactie op hyperthermie vergeleken met de controle, als reactie op amphetamine vergeleken met de controle en bij hyperthermie versus amphetamine.

Ten slotte zien we hier genen met een expressie die meer dan 15 keer zo hoog is in MAV vergeleken met de pariëtale cortex en het striatum, gekenmerkt naar functie. Veel van deze genen zijn gerelateerd aan het vasculaire systeem en/of het immuunsysteem. Andere genen met zeer grote fold changes zijn extracellulaire matrixeiwitten, solute transporters, en het lipide- en retinoïnezuurmetabolisme.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om geduldig te zijn bij het dissekeren van de MAV. Het is daarnaast essentieel dat de hersenen gedurende de gehele dissectie ondergedompeld blijven in isotone zoutoplossing of fosfaatgebufferde zoutoplossing. Verder wordt geadviseerd om de sectie van de MAV bij vier of vijf ratten te oefenen voordat er weefsels worden verzameld voor het genereren van experimentele gegevens.