Het visualiseren van Bacteriën in Nematoden met behulp van fluorescentie microscopie

Het algemene doel van deze procedure is om fluorescent gelabelde bacteriële symbiose binnen hun nematodengastheer waar te nemen. Dit wordt bereikt door de bacteriën eerst te labelen met een fluorescent eiwit via conjugatie. De tweede stap is het isoleren van AIC-nematoden door eieren te oogsten.

Vervolgens worden de AIC-nematoden gekweekt in combinatie met hun fluorescentielabelle bacteriële symbiont om natuurlijke associatie en uiteindelijk de lokalisatie van de bacteriële symbiont binnen de nematode-gastheer mogelijk te maken. De frequentie van deze associatie binnen de nematodepopulatie kan worden bepaald met fluorescentiemicroscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van de symbiose, zoals waar bacteriën zich lokaliseren binnen hun gastheer en wat de distributie is van bacteriële dragerschap binnen een gastheerpopulatie?

Na overnight-groei van de bacteriële stammen worden de donor-, recipient- en helperstammen gesubcultiveerd in voedingsrijke groeimedia zonder antibiotica in een verhouding van 1:100 cultuur tot medium. Laat de culturen vervolgens groeien bij de temperatuur die passend is voor elke stam totdat ze de mid-log fase bereiken. Combineer daarna de stammen in één microcentrifugebuisje en centrifugeer de gemengde culturen gedurende twee minuten bij 17.900 Gs. Decanteer het supernatant en resuspendeer het pellet in 30 µL vers medium. Spot vervolgens de suspensie op een voedingsrijke mediaplaat zonder antibiotica en laat de spot opdrogen.

Incubeer de plaat overnacht in omgekeerde positie bij een temperatuur die optimaal is voor de ontvangende bacterie en toegestaan voor de donor en helper, indien van toepassing. Schraap vervolgens de spot af en strijk deze uit voor enkelvoudige kolonies op een selectieve antibioticaplaat om een zuivere kweek van bacteriën te verkrijgen; strijk een enkele kolonie uit voor isolatie. Controleer ten slotte of de resulterende kolonies de ontvangende symbiont zijn en niet de donorstam.

Door te screenen op de aanwezigheid van recipiëntspecifieke fenotypes. Zo kunnen cino abdi-bacteriën worden onderscheiden van e coli door een katalasetest uit te voeren; er kan worden gescreend op de aanwezigheid van het plasmide door fluorescentie te bevestigen onder de golflengte die overeenkomt met het fluorescerende plasmide-eiwit. Verspreid na het overnacht kweken van de natuurlijke bacteriële symbiont 600 µL van de bacteriële cultuur over acht tot 10 lipid-agarplaten van 10 mm, en incubeer de platen vervolgens in het donker zonder vocht bij 25 °C.

Voeg na twee dagen 5 000 infectieuze juveniele nematoden in 500 µL medium toe aan de bacteriële lawns. Nadat de platen nog drie dagen bij 25 °C zijn geïncubeerd, wordt 20 µL water op een microscoopglaasje geplaatst. Gebruik vervolgens een steriel stokje om een kleine hoeveelheid nematoden van de bacteriële lawn af te schrapen.

Plaats het stokje in het water om de nematoden weg te laten zwemmen. Bekijk deze plaat onder lage vergroting. Indien eitjes en vrouwtjes zichtbaar zijn, ga dan verder wanneer de vrouwtjes eitjes bevatten; breng enkele milliliters water aan op het oppervlak van de platen, draai voorzichtig met de platen en giet het water vervolgens in een conische buis van 50 milliliter.

De nematoden moeten van de platen afkomen en niet langer zichtbaar zijn op het platoppervlak. Laat de nematoden naar de bodem van de buis zakken, pipetteer vervolgens het overtollige water van de bovenkant van de buis en vul de buis opnieuw met schoon water. Nadat de volwassen nematoden zijn neergezakt en het overtollige water nogmaals is weggepipetteerd, vult u de conische buizen met de eisolutie.

Meng de buisjes vervolgens door ze precies 10 minuten bij kamertemperatuur voorzichtig om te keren. Centrifugeer de conische buisjes na het schudden onmiddellijk precies 10 minuten bij 1 250 Gs en kamertemperatuur met de rem ingeschakeld. Schenk daarna snel het supernatant af, resuspendeer het pellet met de eiloplossing door te pipetteren en vul de conische buis aan met verse eiloplossing.

Meng de eissuspensie goed door de buis drie tot vijf keer om te keren en pelleteer vervolgens onmiddellijk de eieren en decanteer het supernatant zoals zojuist getoond. Resuspendeer het pellet in misogyny-bouillon of LB door te pipetteren en breng de eissuspensie vervolgens over naar een conische buis van 15 milliliter. Vul nu de buis van 15 milliliter met LB, was de eieren drie keer in de bouillon met behulp van dezelfde snelle staptechniek als zojuist gedemonstreerd, en verdun de geresuspendeerde P nematode-eieren vervolgens tot ten minste 10 eieren per µL.

Breng de eieren over naar een Petri-schaal van zes centimeter met vijf milliliter LB en antibiotica tegen koloniserende bacteriën. De plaat mag na overnight groei en selectie van de fluorescerende bacteriën tot vier dagen in folie gewikkeld worden bewaard. Gebruik een steriel stokje om 600 microliter van de bacteriecultuur over 10 millimeter lipid aerates te verspreiden en incubeer de cultuur bij 25 graden Celsius.

Verdeel na twee dagen 500 tot 5.000 nematode-eieren over elke lipidplaat. Indien de plaat is bewaard, was de eieren dan minstens één keer in 15 milliliter LB, zoals zojuist gedemonstreerd, voordat de eieren worden geïnoculeerd op de eerder voorbereide bacteriële gazons. Incubeer vervolgens de co-culturen van nematoden en bacteriën in het donker, zonder vocht, bij 25 °C totdat infectieuze juvenielen zichtbaar worden als een pluizige witte ring aan de rand van de plaat.

Wanneer de infectieuze juvenielen zijn waargenomen, wordt het deksel van de lipid-agarplaat verwijderd en wordt de bodem van de plaat in de bodem van een lege Petrischaal van 100 millimeter bij 20 millimeter geplaatst. Vul de Petrischaal vervolgens met voldoende water tot ongeveer de helft van de hoogte van de kleinere plaat en incubeer de waterval totdat de nakomelingen van de infectieuze juvenielen in het water zijn terechtgekomen.

Nadat de nematoden uit het water of in het gewenste levensstadium van de passende bacteriële plaag zijn verzameld, lost u enkele korrels ole op in 30 µL water en voegt u één tot twee µL van dit verlammingsmiddel toe per 50 µL nematodenmonster. Breng vervolgens ongeveer 20 tot 30 µL van het verlamde nematodenmonster over naar een microscoopglas en plaats een dekglas op het monster. Bekijk de nematoden met behulp van lichtmicroscopie om te controleren of de nematoden zich in het gezichtsveld bevinden.

Om de lokalisatie van de bacteriën te bepalen. Fotografeer de nematoden met fluorescentiemicroscopie in aanvulling op de lichtmicroscopische instelling en leg de beelden vervolgens over elkaar heen. Het kan nodig zijn om verschillende vergrotingen en aanzichten van de nematode te proberen om de bacteriën te vinden.

Een populatie nematoden uit twee media werd geteld en gescoord op kolonisatie door de bacteriële symbiont. Voor robuuste statistiek is het raadzaam om ten minste 100 nematoden per monster te tellen, waarbij er ten minste 30 in elke categorie vallen, zoals weergegeven in de tabel. Deze nematoden zijn gekoloniseerd op een niveau van ongeveer 14,6% wanneer ze zijn gekweekt op lipidagar en 68,6% wanneer ze zijn gekweekt op lever- en nieragar.

Andere nematode- en bacteriesoorten vertoonden verschillende colonisatiegraden. Dit schema illustreert het algemene uiterlijk van Steiner NEMA-vrouwtjes. De inzet toont de differential interference contrast-afbeelding van een S fot graphic-vrouwje bij een vergroting van 20 x.

De zwarte pijl in het inzetstuk geeft de vulva aan, terwijl de witte pijlen wijzen naar zichtbare eieren. Deze afbeelding toont een ontwikkeld maar niet uitgekomen ei van een volt-nematode bij een vergroting van 40 x; deze eieren, geïsoleerd van s Volta-nematoden, zijn gefotografeerd bij een vergroting van 10 x. Hier worden in deze eerste afbeelding representatieve microscopische beelden getoond van Steiner Nima-nematoden in associatie met Xeno aptus-bacteriën.

De nematoden van Alvin werden geassocieerd met hun bacteriële symbiont expo die GFP tot expressie bracht om deze samengestelde afbeelding te creëren. Een fasecontrastafbeelding werd over een fluorescentieafbeelding gelegd. De pijl geeft de bacteriën aan die aanwezig zijn in de infectieuze juvenile nematode.

Deze afbeelding toont een juveniele nematode van S carpa capsi met GFP-expressie van X nla. De afbeelding is op een vergelijkbare manier samengesteld als de vorige afbeelding en beeldt de juveniele nematode uit met bacteriën, gelabeld met groen fluorescent eiwit, die zichtbaar zijn als groene staafjes gelokaliseerd in het lumen van de darm van de nematode. In aanvulling op de beschreven procedure kunnen andere methoden, zoals genetische manipulatie van de bacteriële symbiont voorafgaand aan de associatie met de nematodegastheer, worden geïntegreerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat de moleculaire mechanismen zijn die noodzakelijk zijn voor de associatie tussen gastheer en microbe.