Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van F1 F zero APA-vesikels uit de rattenhersenen voor het uitvoeren van patchclamp-metingen. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen uit een rat te verwijderen en deze te homogeniseren. De tweede stap is het openbreken van synaptische zones door druk uit te oefenen.

Vervolgens worden de synaptosomen op de fialengradiënten gelaagd. De laatste stap is incubatie met digitonine en L om de uiteindelijke blaasjes voor patchclamp-registratie te verkrijgen. Een belangrijke functie van mitochondriën is de productie van ATP via oxidatieve fosforylering.

Het enzym dat verantwoordelijk is voor de productie van ATP is de ATP-synthase, gelokaliseerd in het binnenmembraan van de mitochondriën. Om de functie van de ATP-synthase in detail te bestuderen, isoleren we speciale submitochondriale blaasjes, die we SMV's noemen. Deze bevatten het ATP-synthase-enzym in een inside-out configuratie.

Vervolgens registreren we deze SMV's met een patchclamp-elektrode en bepalen we de lekstroom van hun membraan. Dit geeft ons informatie over de efficiëntie van de TP-productie door de mitochondriën. Deze procedure zal vandaag worden gedemonstreerd door Sylvia ti, een postdoctoral fellow in mijn laboratorium aan de Yale University.

Bij deze procedure wordt, nadat de kop van een rat door onthoofding is verkregen, de huid doorgesneden om de schedel bloot te leggen, waarna de schedel voorzichtig wordt geopend door deze door te knippen met een schaar of Rons-scharen. Verwijder vervolgens de hersenen en hak de hersenen, zonder het cerebellum, fijn in een isolatiebuffer. Breng het weefsel daarna over naar een glazen Teflon-homogenisator van 5 mL en homogeniseer het weefsel voorzichtig 10 keer, in totaal ongeveer vijf minuten. Centrifugeer de sample vervolgens 10 minuten lang bij 1.500 ×g bij 4 °C in een tafelcentrifuge.

Bewaar het supernatant met mitochondriën en synaptosomen en gooi het pellet weg. Centrifugeer het supernatant vervolgens opnieuw bij 16.000 ×g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius in een tafelcentrifuge. Gooi daarna het supernatant weg en resuspendeer het pellet in 500 µL isolatiebuffer. Disrupt de synaptosomen met een celdisruptievat door een druk van 1.200 PSI gedurende 10 minuten toe te passen, gevolgd door snelle decompressie. Laag de gedisrupte synaptosomen op centrifugebuizen met twee verschillende concentraties Ficoll, waardoor twee lagen worden gevormd.

Plaats de buisjes vervolgens in een SW 50.1 rotor en centrifugeer 20 minuten lang bij 126.500 ×g bij vier graden Celsius. In een ultracentrifuge is het pellet bestaande uit de gezuiverde mitochondria. De laag tussen de verschillende dichtheden in de buis is het ongestoorde synaptosoom.

Was daarna de pellet door deze afzonderlijk te centrifugeren in isolatiebuffer bij 16.000 ×g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius in een tafelcentrifuge. Resuspendeer de mitochondria vervolgens in 200 µL isolatiebuffer, gecombineerd met een gelijk volume 1% digitonine.

Plaats het 15 minuten op ijs. Voeg vervolgens meer isolatiebuffer toe en centrifugeer 10 minuten bij 16,000 ×g bij vier graden Celsius. Herhaal deze procedure twee keer, resuspendeer het pellet vervolgens in 200 µL isolatiebuffer, voeg twee µL van de 10% Lu-bra-PX-mix toe en plaats dit 15 minuten op ijs.

Laag daarna het mengsel in isolatiebuffer in de centrifugebuizen. Plaats de buizen in een SSW 50.1-rotor en centrifugeer deze bij 182.000 ×g bij vier graden Celsius gedurende één uur. Na een uur.

Was het uiteindelijke pellet door het te centrifugeren in isolatiebuffer bij 16,000 ×g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Een typische electrofysiologische opstelling bestaat uit een versterker, een pc uitgerust met een digi data 1,440, een analoog-digitaal converter-interface in combinatie met P clamp 10.0 software, manipulatoren, een microscoop, een trillingsisolatietafel en een kooi van Faraday. Trek eerst een pipet uit een borosilicaatglazen capillaire buis met een flaming brown micropipet-trekker.

De optimale weerstand van de pipet moet tussen de 80 en 100 mega ohm liggen. Voeg de sub-mitochondriale vesikels toe in een fysiologische intracellulaire oplossing. Vul vervolgens een patchclamp-pipet met dezelfde oplossing.

Visualiseer de blaasjes onder fasecontrastmicroscopie nadat de SMV's bij kamertemperatuur zijn gepatcht. Registreer de activiteit terwijl het membraanpotentiaal gedurende perioden van 10 seconden wordt vastgehouden bij spanningen variërend van -100 millivolt tot +100 millivolt.

De geregistreerde gegevens worden gefilterd op vijf kilohertz met behulp van de versterkerscircuits en geanalyseerd met Clamp Fit 10.0-software. Deze figuur toont de blot van lysaat bereid uit cytosol en mitochondriën. Het bovenste paneel toont een immunoblot met een antilichaam tegen het cytosolische eiwit GA dh.

Het onderste paneel toont een blot met een antilichaam tegen het mitochondriale binnenmembraaneiwit Cox four. Hier zijn twee representatieve patchclamp-opnames voor en na de toevoeging van 1 mM ATP. De holdingpotentiaal is +70 mV. De stippellijn vertegenwoordigt 0 pA.

Elke meting wordt 10 seconden lang geregistreerd, met een interval van 10 seconden tussen de getoonde metingen. Hier zijn de voorbeeldmetingen van de veranderingen in fluorescentie-intensiteit van de CMA-indicator over tijd in aanwezigheid van SMV's en in afwezigheid en aanwezigheid van ATP. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u mitochondriën isoleert, en sub-mitochondriale blaasjes die F1 FO-ATP-synthase bevatten. Bovendien zou u begrijpen hoe u een resistente verzegeling vormt met een elektrode op het membraan van het blaasje om de kanaalactiviteit van het ATP-synthasecomplex te analyseren.