Massa Cytometry: Protocol voor dagelijks Tuning en Running Cell Samples op een CyTOF Mass Cytometer

Het hoofddoel van deze procedure is het demonstreren van de juiste dagelijkse afstelling en monsteranalyse op een CyTOF-instrument. Eerst wordt het apparaat geassembleerd en ingeschakeld. Vervolgens worden de instrumentinstellingen geoptimaliseerd voor afstelling op het maximale signaal.

De machine is vervolgens klaar om de monsters te analyseren. In de laatste stap wordt de machine gereinigd en uitgeschakeld. Uiteindelijk kunnen optimale celgegevens worden verkregen op basis van specifieke tijdvereisten.

Een visuele demonstratie van deze techniek is essentieel. De dagelijkse procedures voor de opstelling, afstemming en reiniging zijn lastig aan de hand van de handleiding te leren, aangezien er meerdere gelijktijdige softwarestappen aan te pas komen.

U moet ervaring opdoen om een gevoel te krijgen voor de juiste achtergrondniveaus en signaalintensiteiten. Open ten minste 15 minuten voordat u met een experiment begint het CyTOF-softwareprogramma en selecteer instrument setup. Klik vervolgens in het tabblad card cage op de knop heater on om de mantel van de spuitkamer op 200 °C te laten komen.

Vervang de spuit in de spuitpomp door een nieuwe spuit gevuld met milli cube water. Reinig vervolgens de vernevelaar door tweemaal per poort terug te spoelen met 5% Citron. Om eventuele Citron-resten te verwijderen, wordt het terugspoelen herhaald met Milli Q water.

Open vervolgens het ventiel van de argongastank, waardoor het argonlampje aan de voorzijde van het apparaat gaat branden. Bevestig daarna de nebulisator aan de inlaat voor het makeup-gas en verbind de nebulisator met de slang voor de vloeistofintroductie. Plaats het uiteinde van de nebulisator in de witte opening van de verwarmingsmantel op het tabblad RFG-controller in het venster voor de instrumentinstellingen.

Klik op start plasma en klik vervolgens op oké. Nadat de opstartprocedure is voltooid, klikt u nogmaals op oké in het pop-upvenster. Zet nu de spuitpomp aan.

Druk bij het bijvullen van de spuit op de stopknop in plaats van de pauzeknop om de volumeteller te resetten. Zorg ervoor dat de massacytometer 20 minuten is opgewarmd voordat u deze kalibreert. Zodra de machine is gestabiliseerd, klikt u op de knop voor acquisitie-instellingen om het venster met de instellingen voor data-acquisitie te openen. In het tabblad analyten.

Klik op het periodiek systeem om het paneel voor de selectie van isotopen te openen. Selecteer vervolgens de isotopen in de DVS sciences tuning-oplossing zoals vermeld in de handleiding en klik op opslaan. Klik daarna op de knop 'isotopen per meting' om het venster voor de massa's per meting te openen.

Selecteer het aantal pulsen en schaal de y-as opnieuw door een nieuw getal in te voeren en vervolgens op enter te drukken. Vul nu een groene norm-injectiespuit van één milliliter met tuning-oplossing. Draai de monsterpoortselector naar de stand load.

Injecteer 450 µL van de tuning-oplossing en draai vervolgens aan de selector om te injecteren. Wacht tot de isotopen van de tuning-oplossing als strepen in dit display verschijnen. De signalen in de time-of-flight regio van 9.400 tot 9.800 zijn te wijten aan xenon-isotopen in het argongas.

Ga nu terug naar de massa's per leesvenster en klik op de groene afspeelknop. Elke gekleurde lijn vertegenwoordigt geselecteerde isotopen uit het tabblad analyten. Wanneer de isotoopniveaus stabiel zijn, stemt u de huidige selectiestroom af via het vervolgkeuzemenu in het tabblad parameters van het venster met instellingen voor gegevensverwerving.

Voer in het startvenster nul in voor start, en 10 voor finish. Voer 0,5 in voor de stapwaarde en 200 voor de insteltijd. Klik vervolgens op opslaan.

Klik vervolgens terug op het venster voor de massa's per meting en klik op afspelen. Nadat is genoteerd waar de signalen van de isotopen pieken, gaat u naar het tabblad DAC-kanaalconfiguratie van het venster voor de instrumentinstellingen. Scroll naar beneden naar stroom en voer de isotopenpiekwaarde in.

Klik op 'set actual current value' en sla dit vervolgens op. Wijzig daarna het vervolgkeuzemenu naar 'make up gas'. Voer 0,55 in het startvenster, 0,95 in het eindvenster, 0,05 in het venster voor de stapwaarde en 200 in het venster voor de stabilisatietijd in.

Klik op opslaan. Na terugkeer naar het venster voor massa's per meting en het opnieuw klikken op afspelen, zal de x-as nu het debiet van het make-upgas weergeven. Noteer de waarden waar de signalen van de isotopen pieken en observeer de snelle toename van het GD 1 55-signaal aan het einde.

Keer vervolgens terug naar het tabblad voor de instellingen van het DAC-kanaal. Scrol omlaag naar makeup, gas, en voer de nieuwe waarde voor de isotooppiek in. Klik op set actual current value.

Klik vervolgens opnieuw op opslaan om de verhouding tussen het gewenste isotoop en het oxide te registreren. Voer eerst een tweede injectie van 450 µL afstemsoplossing uit. Selecteer daarna op het tabblad parameters 'tijd' uit het vervolgkeuzemenu en voer nul in het venster voor de starttijd, 10 in het venster voor de eindtijd, één in het venster voor de stapwaarde en 200 in het venster voor de stabilisatietijd in.

Nadat u op afspelen heeft geklikt in het venster voor massa's per lezing, gebruikt u de cursor om de hogere waarde voor TM 1 69 of TB 1 59 te lezen, en ook de GD 1 55 waarde. Injecteer nu drie milliliter Milli Q water via de sample loop, gevolgd door 500 microliters DVS wasoplossing. Klik in het tabblad voor massakalibratie op uitvoeren om de voortgang van de reinigingswas te bewaken totdat de intensiteit van de strepen begint af te nemen.

Volg dit vervolgens met drie milliliters milli cube water en monitor tot de strepen zijn gedaald tot achtergrondniveaus. Begin met het invoeren van de zojuist gedemonstreerde monsterisotopen voor de isotopen van de tuning-oplossing en klik vervolgens op opslaan. Open daarna het acquisitievenster en pas de acquisie-instellingen aan naar behoefte voor het monstervolume.

Een monster van 450 µL vult bijvoorbeeld de monsterlus en heeft een looptijd van 600 seconden om vertragingen bij de acquisitie van de celgegevens op te vangen. Stel de acquisitievertraging in op minimaal 30 seconden en de detectorstabiliteitsvertraging op minimaal 20 seconden vóór de run. Was de celmonsters minstens twee keer met milli-Q-water, resuspendeer het monster vervolgens tot een maximale concentratie van 10⁶ cellen per mL en filtreer de resulterende celoplossing door een celzeef van 35 µm.

Om eventuele aggregaten te verwijderen. Voer nu een nieuwe bestandsnaam in voor het huidige monster. Let op dat alle bestanden op de E-schijf moeten worden opgeslagen.

Zet vervolgens de monsterlusventiel in de stand 'laden', injecteer het monster, zet het monsterlusventiel terug in de stand 'injecteren' en klik daarna op run. In het acquisitievenster worden de cellen in het snapshotvenster weergegeven als horizontale verzamelingen markeringen in elk verticaal isotoopkanaal; zij vertonen de beste resolutie bij ongeveer 300 tot 500 cellen per seconde, zoals hier wordt gedemonstreerd.

Wanneer de gegevensverwerving van het monster is voltooid, verschijnt er een pop-upvenster. Klik op oké om de voltooiing van de monstermeting te bevestigen en injecteer vervolgens tussen elk monster ten minste 500 µL MQ-water om eventuele monsteroverdracht te minimaliseren en de machine te reinigen. Injecteer na gebruik 450 µL wasoplossing in de monsterlus. Monitor de afgifte van vrij metaal en spoel de monsterlus vervolgens met drie mL milli Q-water, waarbij de spoeling wordt gemonitord totdat de achtergrondniveaus van de strepen zijn bereikt.

Om het apparaat uit te schakelen, selecteert u het RFG-controller-tabblad van het venster voor de instrumentinstellingen en klikt u op 'stop plasma'. Wanneer de procedure is voltooid, klikt u op 'ok' in het pop-upvenster, waarin wordt aanbevolen om de nebulisator te verwijderen via het tabblad 'card cage'. Schakel de verwarmer uit, sluit het ventiel van de argonvoorziening en trek vervolgens voorzichtig de nebulisator naar achteren om deze uit de spuitkamer te verwijderen.

Draai vervolgens de slang voor monsterintroductie los en leg deze opzij. Draai de aansluiting voor de make-up gasintroductie los tot deze licht beweegt en trek daarna de nebulizer eraf. Reinig tot slot beide poorten van de nebulizer met 5%Citron met behulp van dezelfde spuit en slang als eerder gedemonstreerd, en bewaar de nebulizer afgedekt in 5%Citron tot het volgende gebruik.

Het adequaat spoelen van de massacytometer met UE-water en DVS-wasoplossing vermindert de metaalabsorptie in de slang en andere onderdelen van het apparaat, wat helpt om de achtergrondruis, zoals te zien in deze grafieken, te verlagen. Onjuiste tuning, weergegeven door de magenta lijn, leidde tot een significante toename van de oxidevorming bij m plus 16 in vergelijking met het correct getunede monster, zoals aangetoond door de donkerblauwe lijn. Dit heeft tot gevolg dat de gewenste signalen bij m licht afnemen en de ongewenste achtergrondinterferentie bij m plus 16 significant toeneemt.

Correct wassen en juiste verdunning van de monsters in Milli Q water zorgen voor een minimale achtergrond en de hoogste resolutie van cellen, terwijl de noodzaak voor snelheid in balans wordt gehouden. Vergelijkbaar met de gegevens van een representatief experiment zoals hier getoond, werden polystyreen beads die natuurlijke abundanties van lanthanum 1 39 ODIUM one 40, TERBIUM 1 59, DIUM 1 69 en LUTETIUM 1 75 bevatten, geanalyseerd in de celacquisitiemodus. De gegevens werden geanalyseerd met FlowJo en debris van gebroken beads werd via gating verwijderd.

Het correct afgestelde monster werd bepaald bij een debiet van 0,74 liters per minuut, weergegeven door de donkerblauwe lijn. Bij dit debiet werden hogere signaalintensiteiten waargenomen dan bij de lagere debieten, en dit correct afgestelde monster vertoonde een hoger signaal bij de M-metaalmassa's en minder signaal bij de m plus 16-oxidemassa's dan de onjuist afgestelde signalen. Een detailopname van het signaal bij M-massa LANTHANUM 1 39 en THULIUM 1 69 wordt hier getoond.

Let op dat het debiet van het make-upgas de signaalintensiteit van LANTHANUM 1 39 sterker beïnvloedt dan die van thulium 1 69. Deze grafieken tonen het signaal bij m plus 16 oxidemassa's 1 55 en 180 5, die respectievelijk overeenkomen met de LANTHANUM 1 39 plus oh 16 en thulium 1 69 plus oh 16 oxiden. Let op dat het debiet van het make-upgas het signaal van massa 1 55 veel sterker verhoogt dan het signaal van massa 180 5, aangezien lanthanum 1 39 gemakkelijker oxideert dan thulium 1 69.

De signaalintensiteiten van m en m plus 16 als functie van de flowrate van het makeupgas zijn hier afgebeeld. De ingevulde iconen representeren de massa M, terwijl de open iconen de massa M plus 16 representeren; de kleuren van de lijnen komen overeen met de respectievelijke massa M. Let op dat de signaalintensiteiten van LANTHANUM 1 39 en price ODIUM 1 41 sterk worden beïnvloed door de flowrate van het makeupgas, waarbij zelfs een punt wordt bereikt waarop er meer oxide van massa m plus 16 aanwezig is dan massa M. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de CyTOF correct opstart, afstelt, vervolgens uw monsters analyseert en aan het einde van uw dagelijkse runs de machine correct reinigt en uitschakelt.