Met behulp van kwantitatieve real-time PCR voor donorcel Engraftment bepalen in een concurrerende Murine beenmergtransplantatie Model

Het algemene doel van deze procedure is om een PCR-gebaseerde techniek uit te voeren om donorcel-aanslag in een competitief muismodel voor beenmergtransplantatie te kwantificeren, dit wordt bereikt door eerst beenmergtransplantatie uit te voeren bij vrouwelijke ontvangermuizen met mannelijke donorcellen. Vervolgens wordt perifeer bloed verzameld van ontvangermuizen op verschillende tijdstippen en wordt het genomische DNA geïsoleerd. De monsters worden voorbereid voor een standaardcurve.

Ten slotte wordt real-time PCR uitgevoerd met standaardmonsters en testmonsters. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de aanslag van mannelijke donor-afgeleide cellen in de vrouwelijke ontvangermuizen tonen door berekening tegen een standaardcurve met een bekend percentage mannelijke versus vrouwelijke DNA. Het mannelijke voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals een op flowcytometrie gebaseerde methode, is dat het gevoeliger is, meer economisch is en monsters langdurig kunnen worden bewaard.

Het belangrijkste is dat onze techniek het meest onafhankelijk van strengen is en kan worden gebruikt voor elke genomische achtergrond van muizen, zoals een goed gedefinieerd celoppervlakmerker om de donorcel te onderscheiden van ontvangercellen Na het euthanaseren van FVB nj, mannelijke donor en vrouwelijke muizen onder een laminaire flowkap gebruik kleine scharen en pincetten om het dijbeen en scheenbeen uit te snijden en plaats ze in een 60 millimeter weefselkweekschaal met zes milliliter ijskoud RPMI 1640 met 5% verwarmd geïnactiveerd. FBS gebruik een Kim-doek om spieren en ander weefsel te verwijderen en snijd beide uiteinden van elke botschacht in de schaal af. Verbind vervolgens het uiteinde van de botten met een 23 gauge naald die is bevestigd aan een drie cc spuit gevuld met RPMI 1640 met 5% verwarmd geïnactiveerd FBS en spoel het beenmerg uit.

Gebruik dezelfde naald om het beenmergweefsel te desintegreren door herhaalde aspiraties. Breng de celsuspensie over naar een 15 milliliter centrifugeerbuis en centrifugeer deze vijf minuten bij 400 G.Na het verwijderen van de supernatant, resuspendeer de cellen in één milliliter kamertemperatuur, rode bloedcel lysis, buffer en incubeer gedurende vijf minuten op kamertemperatuur voordat u vijf tot 10 milliliter RPMI 1640 met 5% verwarmd geïnactiveerd FBS toevoegt, de cellen door een celzeef laat gaan en het doorstromende in een nieuwe buis verzamelt. Na het vijf minuten centrifugeren van de cellen bij 400 G en verwijdering van het supernatant, zou de pellet vrij van rode kleur moeten zijn, wat wijst op de volledige verwijdering van rode bloedcellen, resuspendeer in 10 milliliter RPMI 1640 met 5% verwarmd geïnactiveerd FBS na voorzichtig vortexen, voeg een kleine aliquot toe aan een hemo cytometer en tel de cellen.

Bereken het volume cellen dat nodig is om te mengen met vrouwelijke concurrentiecellen in een verhouding van vijf tot twee voor beenmergtransplantatie. Als laatste stap om cellen voor injectie voor te bereiden, meng de donor- en concurrentiecellen, pellet de cellen, was met PBS en resuspendeer in PBS bij een eindconcentratie van vijf maal 10 tot de zesde per milliliter donorcellen en twee maal 10 tot de zesde per milliliter voor concurrentiecellen, vier tot zes uur vóór beenmergtransplantatie. Bestraal vrouwelijke ontvangermuizen met cesium 1 37 gammastraling bij een enkele dosis van 11 grays.

Plaats de bestraalde vrouwelijke muizen in een muizenbegrenzer en injecteer de gemengde donor- en concurrentiecellen via de staarvene in een totaal volume van 0,1 milliliter zodat elke muis vijf maal 10 tot de vijfde donorcellen en twee maal 10 tot de vijfde concurrentie beenmergcellen ontvangt om bloedmonsters te trekken. Na anesthesie verzamelen de muizen ongeveer 50 microliter bloed in EDTA-gecoate buisjes door retroorbitale bloeding. Verzamel ook monsters van leeftijdsgematchte mannelijke en vrouwelijke muizen.

Volgende om genomisch DNA van proefmuizen en muizen te isoleren. Voor de standaardcurve voegt u ongeveer 200 microliter kamertemperatuur RBC-lysebuffer toe aan elk bloedmonster en incubeert u gedurende vijf minuten. Voeg een milliliter PBS toe en centrifugeer om de meeste gelyserde RBC's te verwijderen.

Gebruik vervolgens een bloed-DNA-extractiekit om het DNA te isoleren, pre-warm de eluciabuffer tot 37 graden Celsius. Om de opbrengst te verbeteren, meet u de DNA-concentratie van elk monster. Die met een OD twee 60 tot twee 80-verhouding tussen 1,8 tot 2,0 worden gebruikt voor verdere analyse.

Om een standaardcurve op te zetten, verdunt u het mannelijke en vrouwelijke DNA tot een concentratie van vier nanogram per microliter en bereidt u het DNA-mengsel voor volgens deze richtlijnen. Stel de PCR-reactieplaat op door cybergroen supermix reagens te mengen met de hier getoonde primers en genomisch DNA. Elke 20 microliter reactie bevat 400 nano molair van elke primer en vijf microliter bloedcel genomisch DNA, uitgevoerd in drievoud.

Voer PCR uit volgens de voorwaarden in het tekstprotocol en verkrijg de cyclische drempel- of CT-waarden. Bereken delta CT tijdens de hoeveelheid CT tot de macht van ZY een min CT tot de macht van BCL twee en de ZY een expressieniveaus of twee tot de macht van min delta CT, genereer standaardcurven door het gemiddelde van het drievoud van twee tot de macht van delta CT-waarden te plotten tegen het bekende percentage mannelijke DNA in het mengsel met een lineaire regressiefitting. Hier zijn voorbeelden van standaardcurven die zijn geplot met gemiddelde waarden van twee tot de macht van delta CT tegen percentages van mannelijk DNA.

Deze plot omvat een specifieke smelttemperatuur voor BCL twee en ZFY een amplicons gelokaliseerd op respectievelijk 78,5 en 88,5 graden Celsius. BCL twee wordt gebruikt als referentiegen om de totale hoeveelheid geladen DNA in elke PCR-reactie te normaliseren. BCL twee amplificatiecurven voor elk standaardmonster versmelten met elkaar, onafhankelijk van de hoeveelheid mannelijk DNA, wat wijst op gelijke hoeveelheden geladen DNA.

Echter, ZFY een a