Bepaling van Microbiële extracellulaire enzymactiviteit in Waters, bodem en sedimenten behulp High Throughput Microplaat Testen
1 oktober 2013
Microplaat procedures beschreven voor de colorimetrische of fluorometrische analyse van extracellulaire enzymactiviteit. Deze procedures zorgen voor de snelle bepaling van een dergelijke activiteit in grote aantallen milieu-monsters er binnen afzienbare tijd frame.
Het algemene doel van de volgende procedure is om microbiële extracellulaire enzymactiviteit snel te meten in een verscheidenheid van natuurlijke omgevingen. Dit wordt bereikt door monsters van water of grondslurries toe te voegen aan een microplaat om voldoende replicatie te verkrijgen. Als tweede stap wordt een kunstmatige colormetrische of fluorometrische substraat toegevoegd aan de microplaatputjes, wat enzymatische reacties mogelijk maakt. Vervolgens wordt ofwel absorptie of fluorescentie gemeten om de hoeveelheid eindproduct te bepalen die tijdens de reactie is vrijgekomen.
De resultaten tonen verschillen in extracellulaire enzymactiviteit tussen monsters op basis van de absorptie of fluorescentie van de uiteindelijke reactie. Vandaag gaan we demonstreren hoe we extracellulaire enzymactiviteit kunnen meten in natuurlijke omgevingen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in microbiële ecologie, zoals de snelheid van organische stofverwerking en nutriëntmineralisatie in bodems, sedimenten en wateren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in het gebruik van deze methode worstelen vanwege de moeilijkheid om deeltjes te scheiden van de reactieoplossing, vooral bij het testen van grote aantallen monsters.
Een visuele demonstratie van deze procedure is cruciaal, aangezien een plaatlay-out moeilijk te leren kan zijn en het nemen van metingen op meerdere tijdstippen deze procedure uitdagender kan maken. Colormetrische analyse van extracellulaire enzymactiviteit voor bodems en sedimenten begint met de bereiding van substraatbuffer en standaardoplossingen zoals beschreven in het tekstprotocol voor bodem, bereid een slurry van elk monster dat wordt getest in een steriele 15 milliliter centrifugeerbuis. Voeg een concentratie toe van ongeveer één gram per milliliter met behulp van 50 millimolair acetaatbuffer voor sedimenten.
Voeg voldoende acetaatbuffer toe om de slurry gemakkelijk te pipetten. Het exacte volume van de slurry dat nodig is, zal variëren afhankelijk van het aantal geanalyseerde enzymen, maar een minimum van vijf milliliter wordt aanbevolen. Vortex elke slurry totdat alle klonten van bodem of sediment zijn gedispergeerd.
En noteer het eindvolume. Knip het uiteinde van de pipettetips af met een schaar voordat u gaat pipetteren. Omdat grondslurries de neiging hebben om tips te verstoppen, vortex elke slurry opnieuw en pipetteer onmiddellijk 150 microliters in elk van de zes putjes.
Op een 96-wels diep wel-blok. Het is belangrijk om grondig en regelmatig te vortexen. Om bodemdeeltjes in suspensie te houden, laat minimaal twee putjes per blok leeg als substraatcontrole.
Bereid 1 96-wel-blok voor voor elk te analyseren enzym. Giet ongeveer vijf milliliter acetaatbuffer in een pipette reservoir en gebruik een achtkanaals pipetteerder om 150 microliters van de buffer toe te voegen aan de laatste twee putjes van elk monster.
Voor de monsterbuffercontroles en naar de twee substraatcontroleputjes. Giet ongeveer 10 milliliter van de juiste p-nitrofenol of PNP substraatoplossing in een pipette reservoir en gebruik een achtkanaals pipetteerder om 150 microliters van de substraatoplossing toe te voegen aan de eerste vier putjes van elk monster en aan de twee substraatcontroleputjes. Noteer de tijd zodra de reactie begint, zodra de substraatoplossing wordt toegevoegd.
Bewaar de platen bij kamertemperatuur gedurende 0,5 tot vier uur. De exacte incubatietijd zal variëren afhankelijk van het activiteitsniveau in monsters en het te analyseren enzym. Terwijl de assays worden bewaard, bereid een heldere 96-wel-microplaat voor.
Voor elke diepwel-blok om de absorptie te lezen, pipet 190 microliters gedistilleerd water en 10 microliters één molaire natriumhydroxide in elk putje van de microplaat. Natriumhydroxide vertraagt de enzymatische reactie en verhoogt de pH, wat de kleur van de PNP die tijdens de reactie na incubatie vrijkomt, verbetert. Centrifugeer de 96-wel-blokken gedurende 2000 tot 5000 keer G gedurende vijf minuten om gronddeeltjes te pellen.
Het verwijderen van de vloeistof zonder het pellet te verstoren kan een uitdaging zijn. Men moet vermijden om aanvankelijk te veel grondmonster te gebruiken. Zorg ervoor dat u lang genoeg centrifugeert en gebruik een voorzichtige maar zelfverzekerde beweging om de vloeistof te verwijderen.
Gebruik een multikanaals pipetteerder om 100 microliters uit elk te verwijderen. Wees voorzichtig om het pellet te vermijden. Breng de vloeistof over naar het corresponderende putje op een voorbereide heldere 96-wel-microplaat. Zet de Microplaat lezer aan en stel eventueel benodigde software in. Noteer de absorptie bij 410 nanometer na bepaling van de droge massa van de monsters zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereken de uiteindelijke absorptie van elk monster door de monstercontrole absorptie van de monstertest absorptie af te trekken.
Als substraatcontroles een hoge absorptie hebben van meer dan 0,060, trek deze dan af. Ga verder met het berekenen van de enzymactiviteit in micromol per uur per gram droge massa met behulp van deze vergelijking. Na het organiseren van een zwarte microplaat voor elk enzym volgens het voorbeeld in het tekstprotocol, giet ongeveer vijf milliliter van het eerste watermonster in een pipette reservoir en gebruik een achtkanaals pipetteerder om 200 microliters in alle putjes te pipetten.
In kolom één van de Microplaat, gooi gebruikte pipettetips weg en herhaal dit zo nodig voor elk watermonster om kolommen één tot en met negen te vullen. Stel controles in om te rekening te houden met monsters, standaarden, substraat en blussen op dezelfde zwarte microplaat als de monsters. Monstercontroles bevatten monsterwater en bicarbonaatbuffer en worden niet gebruikt in de activiteitsberekeningen, maar zullen consistentie in het lezen van de lezingen gedurende het verloop van het experiment aantonen.
De bluscontroles bestaan uit monsterwater en een standaard hoeveelheid van de fluorescente tag en worden gebruikt om de diffractie van fluorescentie te meten. In monsterwater en standaardcontroles bestaan uit het substraat gekoppeld of de standaard fluorescente tag respectievelijk en bicarbonaatbuffer. Giet ongeveer vijf milliliter van vijf millimolair bicarbonaatbuffer in een schone pipette reservoir. Pipe
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft microplaat-gebaseerde procedures voor de colorimetrische of fluorometrische analyse van microbiële extracellulaire enzymactiviteit. Deze methoden maken snelle assays van enzymactiviteit in diverse milieumonsters mogelijk.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiële ecologie
- Milieuwetenschappen
- Biochemie
Achtergrond
- Microbiële extracellulaire enzymen spelen een cruciale rol bij de verwerking van organische stof.
- Inzicht in de enzymactiviteit helpt bij het beoordelen van de mineralisatie van nutriënten.
- Traditionele methoden kunnen tijdrovend en arbeidsintensief zijn.
- Deze studie heeft tot doel het assayproces te stroomlijnen met behulp van microplaten.
Doel van de studie
- Om de activiteit van microbiële extracellulaire enzymen snel te bepalen.
- Om de enzymactiviteit in verschillende natuurlijke omgevingen te vergelijken.
- Om onderzoek in de microbiële ecologie te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Monsters van water of bodemsuspensies worden aan de wells van een microplate toegevoegd.
- Colorimetrische of fluorometrische substraten worden toegevoegd om de enzymatische reacties te initiëren.
- Absorbantie of fluorescentie wordt gemeten om de enzymactiviteit te kwantificeren.
- Resultaten worden geanalyseerd om verschillen in enzymactiviteit tussen monsters te identificeren.
Belangrijkste resultaten
- Er werden significante verschillen in extracellulaire enzymactiviteit waargenomen tussen de monsters.
- De methode maakt high-throughput analyse van meerdere monsters mogelijk.
- Er werden uitdagingen genoteerd bij het scheiden van deeltjes uit de reactieoplossing.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de verwerkingssnelheden van organische stof.
Conclusies
- De microplate-methode is effectief voor het bepalen van de enzymactiviteit in verschillende omgevingen.
- Deze benadering kan het onderzoek naar microbiële ecologie verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen zich richten op het optimaliseren van technieken voor de scheiding van deeltjes.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
High-throughput microplate-assays voor microbiële extracellulaire enzymactiviteit maken snelle screening van milieumonsters mogelijk, wat targetvalidatie in bioprocesontwikkeling en pipelines voor enzymontdekking ondersteunt. De methode biedt kwantitatieve, reproduceerbare metingen die mechanische risicoreductie van enzymkandidaten en voorspellend vertrouwen bij de identificatie van leads voor industriële biotechnologische toepassingen faciliteren. Door assaycondities te standaardiseren over diverse monstertypen, verbetert deze aanpak de crossfunctionele samenwerking en de triage van portfolio's in vroege fasen van programma's voor enzymengineering.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de functie van microbiële enzymen in hun natuurlijke milieucontext te onderzoeken, waardoor substraatspecificiteit en katalytische efficiëntie worden verduidelijkt voor doelvalidatie.
- Operationele waarde: Ondersteunt snelle hypothesetoetsing van enzymactiviteit in diverse microbiële gemeenschappen, waardoor mechanistische ambiguïteit bij de identificatie van lead-verbindingen wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Genereert kwantitatieve activiteitsgegevens die go/no-go-beslissingen in enzymengineeringprogramma's informeren door baseline-prestatiemetrieken vast te stellen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een gestandaardiseerd high-throughput platform voor het screenen van enzymvarianten of milieu-isolaten tegen chromogene/fluorogene substraten.
- Operationele waarde: Maakt standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays mogelijk via gecontroleerde microplate-formaten, waardoor de variabiliteit in metingen van extracellulaire enzymen wordt verminderd.
- Schaalbaarheid: Faciliteert de verwerking van grote monstersets met een minimaal reagentiaverbruik, wat grootschalige screening op campagneniveau bij enzymontdekking ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt metingen van enzymactiviteit in het milieu met preklinische evaluatie door dosis-responshulprelaties vast te stellen onder gecontroleerde omstandigheden.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Ondersteunt datagestuurde beslissingen over de progressie van enzymkandidaten door activiteitsniveaus in verschillende monstermatrices te kwantificeren.
- Afstemming van biomarkers: Maakt correlatie van enzymactiviteit met metrieken voor nutriëntencycli mogelijk, wat bijdraagt aan het mechanistische begrip van de enzymfunctie in complexe systemen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De microplaat-assaymethode wordt geïntegreerd in workflows voor enzymontdekking, van de initiële milieubemonstering tot hit-validatie en lead-optimalisatie, waardoor een snelle overgang van ontdekkingsbiologie naar preklinische beoordeling mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van microbiële enzymactiviteit in natuurlijke ecosystemen, waardoor functionele rollen in nutriëntenkringlooppaden worden verduidelijkt.
- Screening: Maakt assays gereed voor gebruik door gestandaardiseerde substraatexpositie en kwantitatieve uitlezing via absorptie of fluorescentie, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen of varianten mogelijk maakt.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metingen van substraathydrolysesnelheden die vergelijking van enzymactiviteit tussen verschillende condities en monsters mogelijk maken.
- Translational Research: Verbindt omgevingsenzymprofilering met preklinische continuïteit door activiteitsbenchmarks vast te stellen voor verdere karakterisering.
- Enterprise Reuse: Creëert een herbruikbare capaciteit voor high-throughput screening van enzymactiviteit over meerdere projecten en doelwitklassen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de validatie van enzymdoelen door middel van reproduceerbare, kwantitatieve activiteitsmetingen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid van enzymassays, waardoor het reagensgebruik per monster en de benodigde handmatige tijd worden verminderd.
- Strategische waarde: Verbetert de efficiëntie van go/no-go-beslissingen in enzyme engineering door duidelijke activiteitsdrempelwaarden voor voortgang te bieden.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van enzymkandidaten mogelijk op basis van kwantitatieve activiteitsprofielen in verschillende omgevingsmatrices.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microbiële ecologie en het ontwerp van enzymatische assays om de juiste substraten en controles te selecteren.
- Afhankelijk van toegang tot microplaatlezers of fluorometers die in staat zijn tot absorptie- of fluorescentiedetectie bij de gespecificeerde golflengten.
- Vereist standaardisatie van monstervoorbereidingsprotocollen tussen teams, in het bijzonder voor de behandeling van bodemslurry en de scheiding van partikels.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen voor verschillende enzymklassen en substraattypes, inclusief de optimalisatie van incubatietijden en quenching-stappen.
- Omvat praktische beperkingen met betrekking tot partikelinterferentie in complexe matrices, wat optimalisatie van centrifugatie- of filtratiestappen kan vereisen.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
1:41
Conducting the Enzyme Assay for Soils and Sediments
5:49
Setting up Water Samples, Sample, Standard, Quench, and Substrate Controls
8:54
Recording Fluorescence
9:50
Calculation of Enzyme Activity per Volume of Water
10:42
Results: Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments
14:44
Conclusion
