Micro-mechanische karakterisatie van Lung weefsel met behulp van Atomic Force Microscopy

Het algemene doel van het volgende experiment is om de lokale mechanische omgeving van het longparenchym te karakteriseren op een ruimtelijke schaal die relevant is voor de aanwezige cellen, door de lokale elastische eigenschappen van vers longweefsel direct te meten met behulp van micro-indentatie via atoomkrachtmicroscopie. Dit wordt bereikt door het met agar opgeblazen longweefsel van de muis met een scheermesje of scalpelblad te snijden om stroken longparenchym voor te bereiden van vijf bij vijf millimeter in lengte en breedte, en 400 µm in dikte. Vervolgens worden de niet-gefixeerde, niet-gepermeabiliseerde stroken longweefsel immunogekleurd, wat de gebieden van interesse identificeert voor de AFM-micro-indentatie.

Vervolgens wordt er een FM-micro-indentatie uitgevoerd op weefselstrips in PBS bij kamertemperatuur. Om de lokale elastische eigenschappen van het verse longweefsel direct te meten, worden resultaten verkregen. Deze tonen opvallende verschillen in het bereik en de distributie van de weefselstijfheid in normaal en fibrotisch longparenchym en grote ruimtelijke variaties in stijfheid, in het bijzonder binnen het fibrotische longmonster.

Gebaseerd op stijfheidskaarten die zijn geëxtraheerd uit geforceerde verplaatsingscurves, verkregen met behulp van FM-micro-indentatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande metingen, zoals het rekken van weefselstrips, is dat het een ongekende ruimtelijke resolutie biedt, wat een uniek perspectief geeft op variaties in weefselstijfheid op microschaal. Deze meting kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen, zoals hoe de stijfheid ruimtelijk varieert binnen het weefsel en wat de reikwijdte en de ruimtelijke schaal van de stijfheidsveranderingen bij de ziekte zijn.

Processen die leiden tot weefselremodellering. Om stroken longweefsel voor te bereiden, begint u met het stabiliseren van de longstructuur voor het snijden door geïsoleerde muizenlongen op te blazen. Blaas intratracheaal 50 milliliters per kilogram lichaamsgewicht van warme, 2% laag-gelpunt agarose in PBS op, knoop de trachea af en koel de opgeblazen longen 60 minuten lang af in een bad van PBS bij vier degrees Celsius. De agarose zal geleren en verstijven in de luchtwegen om de longstructuur voorzichtig te stabiliseren. Snijd tijdens dit interval, met behulp van een scheermesje of scalpel, het met agarose gestabiliseerde longweefsel van de muis in stroken van ongeveer vijf bij vijf millimeters in lengte en breedte, en 400 micrometers in dikte.

Was de strips vervolgens in PBS bij 37 °C gedurende vijf minuten om residuele aros te verwijderen en grote luchtwegen en vaten uit te sluiten. Snijd strips uit subpleurale regio's die ver verwijderd zijn van de hoofdbronchiën; indien luchtwegen en grote vaten moeten worden afgebeeld, snijd dan strips uit longweefsel dat zich proximaal van de hoofdbronchiën bevindt om gebieden van interesse te isoleren voor een FM micro-indentatie. Visualiseer het weefsel met fasecontrastmicroscopie of immunostaining en visualiseer dit vervolgens met fluorescentiemicroscopie.

Raadpleeg het geschreven gedeelte van dit protocol voor de procedure. Bevestig de weefselstrips direct vóór een FM-karakterisering aan met poly-L-lysine gecoate dekglasplaatjes van 15 millimeter door het dekglasplaatje van onderaf tegen het drijvende weefsel aan te tillen, waarbij u erop let dat de weefselstrip gelijkmatig over het oppervlak van het dekglasplaatje verspreid wordt. Indien nodig kunt u de strip klemmen met een tweede schoon, ongecoat dekglasplaatje en lichte druk uitoefenen om de hechting van het weefsel aan het met poly-L-lysine gecoate dekglasplaatje te bevorderen.

Kalibreer het A FM-systeem volgens de instructies van de fabrikant direct voorafgaand aan elke reeks micro-indentatie-experimenten. Bepaal hiervoor twee kritische parameters: de veerconstante van de cantilever met behulp van de thermische fluctuatiemethode in lucht en de deflectiegevoeligheid van de cantilever, een parameter die wordt gebruikt om het uitgangssignaal van de fotodiode te schalen naar de werkelijke deflectieafstand van de cantilever.

Kalibreer de doorbuigingsgevoeligheid door een standaard geforceerde verplaatsingscurve in PBS te verkrijgen op een schoon glazen objectglas. Bereken vervolgens de helling van de geforceerde verplaatsingscurve in de meting van de geforceerde verplaatsingscurve. De A FM-tip wordt naar het sample-oppervlak uitgestrekt en er weer van teruggetrokken op één enkele locatie, waarbij de doorbuiging van de cantilever delta D wordt gemonitord als functie van de tipverplaatsing delta Z. Het wordt aanbevolen om een siliciumnitride driehoekige cantilever te gebruiken met een borosilicaat bolvormige tip met een diameter van 5 µm, gebruikmakend van FM-probes met een veerconstante van 0,06 N/m.

We hebben zachte materialen mechanisch gekarakteriseerd met een afschuifmodulus variërend van 100 tot 50.000 pascals. Veeg het onderste oppervlak van het sample-dekglas af met vloeipapier en bevestig het vervolgens aan een standaard glazen objectglas met vacuümvet. Plaats het objectglas op de AFM-samplehouder en bedek het weefsel met 500 µL PBS op kamertemperatuur.

Plaats vervolgens de A FM-scankop over het monster. Pas de objecttafel van de microscoop aan om de microscoop in te stellen voor oculair-observatie, zodat de A FM-tip in het centrum van het gezichtsveld wordt uitgelijnd. Verplaats de A FM-objecttafel om een interessegebied op het weefsel te selecteren.

Schakel vervolgens over naar weergave via de CCD-camera om, naar wens, fasecontrastbeelden en/of fluorescentiebeelden van het weefsel op te nemen. Beweeg de AFM-tip langzaam naar beneden tot deze nauwkeurig in contact is met het monster. AFM-micro-indentatiekarakterisering van zachte monsters vereist geringe indentatiedieptes om grote lokale vervormingen te voorkomen, welke het Hertz-model dat wordt gebruikt voor de berekening van de elastische modulus zouden ongeldig maken; om grote vervormingen te vermijden, dient de indentatie in triggermodus te worden uitgevoerd door de maximale uitbuiging van de cantilever in te stellen op 500 nanometers.

Deze afbuigingslimiet zal de maximale indentatiekracht beperken tot minder dan 30 nano newtons. De indentatiesnelheid moet voldoende laag worden gekozen om de elastische in plaats van de visco-elastische eigenschappen van het zachte monster te onderzoeken. Selecteer voor longweefsel een snelheidsbereik van twee tot 20 micrometers per seconde voor een enkele meting in een gebied van interesse.

Verplaats de AFM-probe naar de locatie van belang en voer een enkele indentatie uit om een standaard kracht-verplaatsingscurve te verkrijgen. De probe beweegt uitsluitend in de Z-richting. Voor het geautomatiseerd in kaart brengen van een gebied van belang, schakelt u over naar de force map-modus en selecteert u de scanmaat en de bemonsteringspunten binnen het geselecteerde gebied.

De AFM-tip scant over het sample-oppervlak tussen de indentatiebewegingen door en verzamelt individuele kracht-verplaatsingscurves op elk punt binnen een gedefinieerd sample-raster. Wij vonden het praktisch om een raster van 16 bij 16 punten te gebruiken om een gebied van 80 micrometer bij 80 micrometer in kaart te brengen bij een indentatiesnelheid van 20 micrometer per seconde, wat in ongeveer 10 minuten kan worden voltooid. Om de Young-modulus te berekenen, wordt de kracht-verplaatsingscurve gefit aan het Hertz-model voor sferische indentatie met behulp van non-lineaire curve-fitting via de methode van de kleinste kwadraten, zoals hier getoond, waarbij F equals K sub C times delta D de kracht is om de cantilever te buigen.

K sub C is de veerconstante van de cantilever. R is de straal van de bolvormige tip, delta is gelijk aan delta Z minus delta D is de indringing, en new is de Poisson-ratio van de monsters, wat voor longweefsel gelijk is aan 0,4. Om de kwaliteit van de fit te beoordelen, berekent u de SSR-waarde of de som van de kwadraten van het verschil tussen de gegevens en de fitwaarden tijdens de niet-lineaire curvefitting.

Elimineer onbetrouwbare of oninterpreteerbare metingen door gegevens van slechte curven met grote SSR-waarden te verwijderen. Indien gewenst, kan de elasticiteitsmodulus of E worden omgezet naar de afschuifmodulus G met behulp van de relatie E is gelijk aan twee keer de som van een plus new maal G. Om ruimtelijke stijfheidspatronen die in force map-modus zijn verzameld te visualiseren, kunnen modulusgegevens en contourkaarten worden uitgezet, bijvoorbeeld in een raster van 16 bij 16 dat een gebied van 80 µm bij 80 µm beslaat.

Om een grote hoeveelheid gegevens van kracht-afstandscurves te verwerken, kan een aangepast algoritme worden geschreven om kracht-verplaatsingscurves automatisch te fitten, modulaire gegevens te extraheren of contourkaarten of ELA-grafieken te plotten. Met gebruik van dezelfde procedures en parameters als zojuist beschreven, laat deze figuur zien dat het weefsel correct is gesneden en gekleurd. De alveolaire microarchitectuur van het longparenchym is goed behouden, zoals waargenomen via immunofluorescente kleuring voor de basaalmembraancomponent laminine, zonder fixatie of permeabilisatie.

Deze panelen tonen immunofluorescente kleuring voor collageen, één in verse, niet gefixeerde longen geoogst van muizen die eerder behandeld zijn met PBS of behandeld met bleomycine om fibrose te induceren. Voorbeelden van kracht-verplaatsingsgrafieken verkregen via FM-microindentatie worden hier getoond met dezelfde uitgeoefende kracht. De FM-tip veroorzaakt een grote indentatie in een zacht gebied, wat resulteert in een relatief vlakke kracht-verplaatsingscurve (weergegeven in blauw), tegenover een kleine indentatie en een steile kracht-verplaatsingscurve voor een stijver gebied (weergegeven in rood).

Om na elke indentatie schone krachtcurves te verkrijgen, moet de AFM-tip vóór de volgende indentatie volledig van het sampleoppervlak worden teruggetrokken en vrij van contact zijn. Deze contactvrije toestand komt overeen met het vlakke gebied van de curve waarin de tip zich verplaatst zonder deflectie van de cantilever. Deze figuur toont een typische foutieve curve zonder vlak gebied, wat optreedt wanneer de tip niet volledig van het sampleoppervlak is teruggetrokken, bijvoorbeeld wanneer een zacht sample aan de tip kleeft, waardoor het onmogelijk wordt om het contactpunt te bepalen als de tip volledig in het zachte sample gevangen zit.

De curve kan er zo uitzien zonder duidelijke afbuiging, maar met een kleine ruis. Deze figuur toont de stijfheid. Gegevens geëxtraheerd uit gedwongen verplaatsingscurves, ruimtelijk weergegeven als stijfheidskaarten aangeduid als ELAs graft, waarbij de kleur schaalt met de stijfheid; de ELAs graft tonen opvallende verschillen in het bereik en de distributie van de weefselstijfheid in normaal en fibrotisch longparenchym en grote ruimtelijke variaties in stijfheid, in het bijzonder binnen het fibrotische longmonster.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de lokale mechanische omgeving van het longparenchym kan worden gekarakteriseerd door de lokale elastische eigenschappen van vers longweefsel direct te meten met behulp van atoomkrachtmicroscopie.