Generatie afschuifhechting Kaart behulp SynVivo Synthetische Microvascular Networks

Het algemene doel van het volgende experiment is om een zuiverheidslijmkaart van celdeeltje-adhesie te verkrijgen vanuit een enkele proef met behulp van synthetische microvasculaire netwerken. Dit wordt bereikt door eerst de microfluïdische inrichting te coaten met het eiwit van belang, in dit geval avadon. Als tweede stap worden biotinylerde deeltjes geïnjecteerd in de inrichting bij fysiologische afschuifsnelheden, die zich binden aan de avadon gecoate inrichting met verschillende patronen afhankelijk van de lokale afschuifsnelheden.

Vervolgens wordt het aantal gebonden deeltjes geteld om een zuiverheidslijmkaart van de deeltjes te genereren met behulp van een computationeel gecreëerde database van zuiverheidssnelheidswaarden in het netwerk. Resultaten tonen aan dat een zuiverheidslijmkaart kan worden verkregen uit een enkele proef, wat resulteert in aanzienlijke besparingen op tijd en reagentia in vergelijking met de conventionele parallel plate flow chambers. Het primaire voordeel van deze technologie boven bestaande methoden, zoals lineaire flowkanalen, is dat we gedeelde kaarten kunnen genereren uit een enkele proef, wat resulteert in een aanzienlijke besparing in kosten en tijd.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van geneesmiddelafgifte, zoals de mogelijkheid van geneesmiddelafgifte voertuigen om te binden met de gewenste doelen. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we paddle plate flow chambers gebruikten om cel specifieke laesies te begrijpen. Onder vloeistomstandigheden is het doel van deze test echter om basisinzichten te bieden in deeltjes- en celadhesie.

Het syn vivo platform kan worden toegepast op een verscheidenheid aan andere systemen, zoals kanker en CNS-afgifte, infectie en ontsteking, trombose en microcirculatiestoornissen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de microfluïdische apparaat stappen moeilijk te leren zijn, wennen aan kleine steekproefvolumes, en de beste praktijken om belvorming te voorkomen, worden beter visueel gecommuniceerd. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Ashley Smith, een onderzoekswetenschapper van ons lab.

De SynVivo SMN microfluïdische inrichting bestaat uit twee sets parallelle poorten, één voor het laten stromen van oppervlaktecoating, moleculen en/of cellen voor zitting, en de andere voor het uitvoeren van de test. Om te beginnen, dompelt u het apparaat volledig onder in een petrischaal met steriel gedeïoniseerd water en plaats de schotel in een vacuüm. Laat het droogmiddel draaien totdat alle lucht uit de kanalen van het apparaat is verwijderd.

Dit zou ongeveer 15 minuten duren voordat u het apparaat uit het water verwijdert. Gebruik een fijne pincet om tigon-slangen, geprimed met water, in elke poort van het apparaat te plaatsen. De slangen moeten ongeveer een centimeter lang zijn.

Het apparaat kan nu uit het water worden verwijderd met behulp van een pipette of spuit. Plaats een druppel water rond de basis van een inlaatpoortslang. Verwijder voorzichtig de slang.

De druppel water zal voorkomen dat lucht in het apparaat komt. Bereid vervolgens een enkele milliliter spuit gevuld met avadon met een concentratie van 20 microgram per milliliter. Verbind de spuit met een 24 gauge roestvrijstalen naald en slang. Klem de niet-gebruikte inlaatpoort af met een kaakklem.

Voer de slang in de inlaatpoort van het apparaat in. Injecteer avadon met een stromingssnelheid van één microliter per minuut gedurende 10 minuten om volledige perfusie van het apparaat mogelijk te maken. Aan het einde van de stromingstijd.

Klem alle slangen met kaakklemmen af en plaats het apparaat gedurende een nacht op vier graden. Laat het apparaat op kamertemperatuur komen. Plaats vervolgens het apparaat op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop uitgerust met een gemotoriseerde stage en een hoogwaardige camera.

Bereid een oplossing van twee micron biotinylerde deeltjes voor met een concentratie van 5 miljoen deeltjes per milliliter in fosfaat buffer zoutoplossing of PBS. Laad de deeltjes in een enkele milliliter spuit. Bereid een tweede enkele milliliter spuit van PBS voor.

Laad elke spuit op een spuitpomp en verbind ze vervolgens met naald en slang met behulp van een pipetterspuit. Plaats een druppel water rond de basis van de inlaatpoortslang en verwijder voorzichtig de slang die werd gebruikt om het apparaat te coaten. Voer voorzichtig de slang in voor biotinylerde deeltjes en voor PBS in elk van de inlaatpoorten.

Begin vervolgens met het injecteren van biotinylerde deeltjes met een stromingssnelheid van 2,5 microliter per minuut. Controleer de inlaatpoort op de microscoop bij het eerste teken van deeltjes. Begin de timer en blijf drie minuten doorstromen.

Na de drie minuten, stop de stroming van biotinylerde deeltjes terwijl u tegelijkertijd de stroming van PBS start met een stromingssnelheid van 2,5 microliter per minuut. Laat PBS drie minuten door het apparaat stromen om ongebonden deeltjes af te spoelen. Gebruik de scan grote afbeelding functie in de beeldvormingssoftware om het beeld van het hele apparaat te verkrijgen, nummer vervolgens de vertakkingen in het apparaat en creëer een circulair gebied van belang met twee keer de diameter van de kanalen.

Stel in dit geval de diameter van het gebied van belang in op 200 micron aangezien de kanaaldiameter 100 micron is. Gebruik de geautomatiseerde telfunctie in de beeldvormingssoftware om het aantal deeltjes in elk gebied van belang te exporteren naar een spreadsheet. Gebruik evenzo de geautomatiseerde account functie om het aantal deeltjes in het hele apparaat te exporteren.

CFD simulaties worden uitgevoerd en de resultaten worden opgeslagen in een database voor verdere analyse. De informatie in de resultaten omvat wandschuifsnelheden, deeltjesflux, en hechting aan het apparaat. De informatie hier wordt gebruikt om het aantal deeltjes te bepalen dat hecht bij elk gebied van belang gegeven een gedefinieerde invoer van een deeltjesconcentratie.

Om een zuiverheidsadhesiekaart te genereren, berekent u het percentage hechting zoals beschreven in het tekstprotocol als laatste stap. Plot de