Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

Het algemene doel van deze procedure is om post-translationele modificaties van eiwitten die betrokken zijn bij plantaardige eiwitcomplexen eerst tijdelijk of stabiel te identificeren in plana de tags van het eiwit van belang. Vervolgens de totale eiwitten uit het plantenweefsel extraheren, en het eiwit van belang immunoprecipiteren. Vervolgens de immuno geprecipiteerde eiwitten scheiden op een acrylamidegel en de eiwitten extraheren en verteren uit de gelband van belang.

Dien nu de eiwitmonsters in voor massaspectrometrie. Uiteindelijk kunnen de resultaten van massaspectrometrie dynamische veranderingen in post-translationele modificaties zoals fosforylering detecteren. In tegenstelling tot alternatieve methoden zoals de in vitro incubatie van kinase met substraat, drukt deze methode eiwitten uit in planter.

Dus je hoeft niet te weten welke kinase verantwoordelijk is voor fosforylering. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van plantenbiologie, zoals hoe signalen worden getransduceerd als reactie op stress, veranderingen in het milieu of ziekteverwekkerherkenning. Naast de identificatie van fosforylering, sites van geactiveerde weerstandseiwitcomplexen, kan deze methode breed toegepast worden op elke post-translationele modificatie van elk plantaardig eiwitcomplex.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat ze niet gewend zijn om met grote hoeveelheden extract te werken en meer stappen van het protocol op één dag uit te voeren. Voor tijdelijke expressie, groei de agrobacterium tohin stammen tot stationaire fase. Oogst de agro bacteriën door centrifugatie bij 3000 Gs gedurende vijf minuten.

Resuspendeer de pellets en infiltratie buffer.Buffer. Nu infiltreert. Vier weken oude NCOA hamana planten met agro bacteriën handmatig met een naaldloze spuit van één milliliter of door vacuüm met 0,02% oppervlakteactieve stof, twee tot vijf dagen na infiltratie.

Oogst de geïnfiltreerde bladeren, bladeren, bevries ze in vloeibare stikstof en bewaar ze bij minus 80 graden Celsius. Maal vervolgens 20 gram plantenweefsel en vloeibare stikstof met een vijzel en stamper bij 80 milliliter koude buffer C naar de 20 gram. Meng goed en ontdooi op ijs.

Homogeneiseer nu met drie bursts van tien seconden elk op volle snelheid. Filter het homogenaat en centrifugeer gedurende 30 minuten bij 30.000 Gs bij vier graden Celsius. Ondertussen tot 100 microliters van een geschikt affiniteitsmatrix bij 500 microliters van koude blokkeringsbuffer D gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en was drie keer met één milliliter van koude buffer D.Verwijder vervolgens het supernat van het bladextract en laat het door een 0,45 micrometer spuit filteren.

Filter in een nieuwe buis op ijs. Deel de ruwe extract. Voor een immunoblot.

Voeg vijf XSDS-pagina laadbuffer toe, vortex en kook de monsters om te denatureren. Voeg 50 microliters van de affiniteitsmatrix, gesuspendeerd in buffer D, toe aan elke buis. Incubeer met zacht draaien gedurende twee uur bij vier graden Celsius, centrifugeer om de affiniteitsmatrix te pelleten.

Neem vervolgens een aliquot van het ongebonden extract voor een immunoblot. Gooi de rest van het sane weg, waarbij ongeveer 500 microliters in de bodem van de buis achterblijft. Resuspendeer de slurry-oplossing met een tip met een brede boring.

Verzamel de gemengde slurry-oplossing uit beide buizen in een enkele 1,5 milliliter buis. Pulseer drie keer gedurende vijf seconden met behulp van een tafelcentrifuge om de affiniteitsmatrix te precipiteren en verwijder het supernat na drie tot vijf wasbeurten met één milliliter van koude buffer D.Verwijder het overtollige buffer D met een spuitnaald eluteert met 200 microliters van de geschikte elutiebuffer onder constant schudden. Trek de drie EIT's in een enkele buis.

Concentreer vervolgens de eiwitten door 30 microliters van absorptiehars vortex te gebruiken. Laat het vijf minuten staan en precipiteer het hars, gooi het supernat weg. Voeg 50 microliters van één XSDS-pagina laadbuffer toe aan de geprecipiteerde affiniteitsmatrix of absorptiehars vortex en kook gedurende 10 minuten bij 80 tot 100 graden Celsius in een hitteblokcentrifuge.

De gekookte affiniteitsmatrix zijn hars gedurende twee minuten bij 10.000. GS aliquot vijf microliters van het supernat voor immunoblok en voer met andere fracties uit op een 10 centimeter lange SDS-pagina. Gel voor scheiding en identificatie van gefosforyleerde eiwitten door massaspectrometrie.

Laad de resterende 45 microliters op een SDS-pagina gel en kleed de SDS-pagina gel met colloïdaal kamasi brillant blauw. Was vervolgens de gel met overvloedig wassen en water, bij voorkeur overnacht.

Nu snijdt u met een schone scalpel de band van belang uit de gel, snijdt de gelplak in blokjes van twee tot vier millimeter en brengt u het monster over in een buis. Was de gelstukken met 50% acetonitril en 50 millimolair ammoniumbicarbonaat tot de verkleuring is verdwenen. Pipet vervolgens de oplossing af.

Zorg ervoor dat u geen gelstukken verwijdert. Dehydrateer het monster met 100% acetonitril gedurende vijf minuten en verwijder het vrije vocht. Breng vervolgens het vrije vocht over om de eiwitdisulphidebindingen te verminderen bij 10 millimolair DTT en incubeer gedurende 30 tot 45 minuten bij 56 graden Celsius met schudden, verwijder nu het vrije vocht om cysteïneresiduen te alkyleren.

Voeg 55 millimolair chloroacetamid toe gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Verwijder het vrije vocht, was vervolgens de gelstukken twee keer gedurende 10 minuten met 50% acetonitril. Verwijder vrij vocht.

Dehydrateer nu de gelstukken met 100% acetonitril gedurende vijf minuten en verwijder vrij vocht voor de Triptych Digest. Bij 40 microliters trypsine werkoplossing, laat de gelstukken gedurende 10 minuten rehydreren bij voldoende verteringsbuffer om de gelstukken te bedekken. Incubeer gedurende een nacht bij 37 graden Celsius om de vertering te stoppen en extraheer de peptiden uit de gelstukken bij 5% formique zuur soniqueer gedurende vijf tot tien minuten.

Breng