Eiwit-eiwit interacties gevisualiseerd door Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie in Protoplasten en Bladeren Tabak

Het algemene doel van het volgende experiment is om de interactie van twee eiwitten die worden geëxpresseerd in intacte tabaksbladeren te monitoren. Dit wordt bereikt door het ontwerpen van geschikte constructen, het fuseren van de twee genen van belang met gesplitste fluorescente eiwitten en het transformeren van deze constructen in agrobacteriën. Als tweede stap worden agrobacteriëncultures gemengd en geïnjecteerd in tabaksbladeren, wat leidt tot expressie van de eiwitten en een gereconstitueerd fluorescent signaal.

Als de eiwitten in nauwe nabijheid komen, worden vervolgens hele bladeren of geïsoleerde protoplasten onder de microscoop geanalyseerd. Er worden resultaten verkregen die eiwit-eiwitinteracties laten zien op basis van het uitgestraalde fluorescente signaal dat wordt gedetecteerd door fluorescencmicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals cor immunoprecipitatie of gista hybride is dat de eiwit-eiwitinteractie direct kan worden gemonitord in de levende plantcel.

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van plantenbiologie te beantwoorden, zoals de vorming van eiwitcomplexen in verschillende cellulaire compartimenten. Om met deze procedure te beginnen, kweekt u de agrobacteriën die worden gebruikt voor transformatie van de tabaksbladeren. Inoculeer 10 milliliter LB-medium met de juiste antibiotica met 50 microliter van de AG L een glycerolstockcultuur die het plasmide van belang bevat in een steriele 50 milliliter buis.

Incubeer bij 28 graden Celsius gedurende ten minste 24 uur, schuddend bij 190 RPM totdat de cultuur de volgende dag een OD 600 tussen 1,0 en 2,0 bereikt. Centrifugeer de bacteriën bij 3000 keer G gedurende 15 minuten. Gooi het supernatant weg en suspendeer de pellet in vers gemaakt infiltratiemedium en pas de suspensie aan tot een OD 600 van 1,0.

Incubeer de agrobacteriëncellen in een overhead shaker gedurende twee uur in het donker bij kamertemperatuur voor infiltratie van tabaksbladeren. Kies verschillende oudere bladeren van een drie weken oude tabaksplant. Meng gelijke volumes.

Drie milliliter van elke agrobacterie die de constructen van belang draagt. Vul een vijf milliliter spuit zonder naald met de celsuspensiemix om de celsuspensie in de tabaksbladeren te infiltreren. Druk de spuit voorzichtig op de onderkant van de bladeren op verschillende plaatsen, geef de planten water en laat ze twee dagen bedekt en beschermd tegen licht.

Om protoplasten uit een geïnfiltreerd blad te isoleren, plaatst u eerst het blad in een petrischaal en voegt u wat vers bereide enzymoplossing toe. Snijd het blad met een nieuw scheermes in stukken van ongeveer 0,5 vierkante centimeter. Breng vervolgens de bladstukken met de enzymoplossing over in een vacuüm.

Infiltratiefles. Vacuüminfiltreer gedurende ongeveer 20 seconden totdat luchtbellen uit de bladeren opkomen. Laat het vacuüm heel voorzichtig los.

Schudden de fles gedurende 90 minuten bij 40 RPM in het donker bij kamertemperatuur na 90 minuten. Laat protoplasten los door een minuut lang te schudden bij 90 RPM. Filtreer de oplossing door gaas in een 15 milliliter centrifugeerbuis met ronde bodem.

Bedek de protoplastenoplossing met twee milliliter FPCN-buffer en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 70 keer G met langzame versnelling en vertraging bij kamertemperatuur. Intact Protoplasten zullen zich ophopen op het grensvlak tussen de enzymoplossing en FPCN. Gebruik een pijptip met een brede opening van één milliliter om de intacte protoplasten over te brengen naar een nieuwe centrifugeerbuis. Gebruik voor het succes van deze procedure altijd witte orifice-tips om breuk van intacte protoplasten te voorkomen.

Vul de buis met W vijf buffer en centrifugeer gedurende twee minuten bij 100 keer G met langzame versnelling en vertraging. Om de protoplasten te pelleteren, verwijdert u voorzichtig het supernatant en suspendeert u het pellet opnieuw. In ongeveer 200 microliter W vijf buffer, afhankelijk van de hoeveelheid protoplasten.

Om een protoplastenmonster voor laserscanmicroscopie voor te bereiden, plaatst u eerst twee kleine stroken afdichtmiddel op ongeveer twee centimeter afstand op een microscoopglaasje. Plaats 20 microliter van de protoplastenoplossing tussen de stroken en plaats voorzichtig een dekglaasje erop. De afdichtingsstroken voorkomen dat de protoplasten worden verpletterd door het dekglaasje.

Om een totaal bladmonster voor laserscanmicroscopie voor te bereiden, snijdt u een centimeter stuk van het blad en plaatst u het op een microscoopglaasje met de onderkant van het blad naar boven. Voeg ongeveer 30 microliter water toe. Plaats een dekglaasje erop en fixeer het stevig met plakband aan beide kanten.

Beeldvorming wordt uitgevoerd met een confocale laserscanmicroscoop van MICCA type TCS SP vijf voor vergroting. Gebruik een objectieflens met een grootte van 63 x met glycerol als beeldvormingsmedium, gebruik de Leica Application Suite Advanced Fluorescent software voor evaluatie. Stel de Argonne-laser in op 30%en de laserkracht bij 488 nanometer op een intensiteit van 18%. Om het signaal bij 515 nanometer te monitoren, stelt u de eerste PMT-detectoremissiebandbreedte in van 495 tot 550 nanometer.

Om chlorophylle autofluorescentie te monitoren. Stel een tweede PMT-detectoremissiebandbreedte in van 650 tot 705 nanometer. Om het M-cherrysignaal te monitoren, gebruikt u de HENI 5 61-laser.

Stel de intensiteit van de laser in op 18%en een derde PMT-detectoremissiebandbreedte van 587 tot 610 nanometer. Zorg ervoor dat foto's van alle PMT-detectorkanalen worden genomen met dezelfde versterkingsinstellingen. De versterking moet tussen 800 en 900 liggen om achtergrondsignalen uit te sluiten.

Verzamel beelden in dit formaat, breedte en hoogte van 1024 bij 1024 pixels met een scanfrequentie van 100 hertz. Gebruik voor Z-stackings een maximale afstand van 0,5 micrometer tussen elke stack. In deze studie werd de BFC-methode gebruikt om de interactie van de cytosolische moleculaire chap