Differentiële Labeling van Cell-oppervlak en Internalized Eiwitten na Antibody Voeden van Levende gekweekte neuronen

Het algemene doel van deze procedure is om eiwitten op het oppervlak van levende neuronen te labelen en vervolgens oppervlakte-eiwit te onderscheiden van geïnternaliseerde eiwitten door middel van differentiële secundaire antilichaamlabeling. Om dit te doen, worden primaire neuronen gekweekt op dekglas geïncubeerd met een antilichaam gericht tegen een oppervlakte-epitoop en geïncubeerd om internalisatie mogelijk te maken. Na de incubatie wordt een fluorescerend gelabeld secundair antilichaam aangebracht om blootgestelde oppervlakte-eiwitten te identificeren.

Vervolgens wordt overtollig ongelabeld secundair antilichaam aangebracht om eventuele resterende complexen van oppervlakte-eiwit en primaire antilichamen te blokkeren. De gekweekte neuronen worden daarna gepermeabiliseerd en een secundair antilichaam van een andere kleur wordt aangebracht om geïnternaliseerd eiwit te detecteren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de relatieve niveaus van geïnternaliseerd versus oppervlakte-eiwit tonen via immunofluorescentiemicroscopie.

Na deze procedure kan een tijdsverloop van de internalisatie van oppervlakte-eiwitten worden verkregen, wat informatie oplevert over de eiwittransportsnelheden onder basale en gestimuleerde omstandigheden. Begin deze procedure door dekglasjes voor celcultuur voor te bereiden. Was polylysine gecoate 18 millimeter bolische glasdekglasjes die een dag eerder zijn voorbereid door ze in drie afzonderlijke spoelbakken met PBS te dopen. Voeg 500 microliter laminine-oplossing toe aan de putjes van een 12-putjesplaat en plaats de dekglasjes vervolgens met behulp van een pincet in elk putje. Druk op elk dekglasje om ervoor te zorgen dat het vlak in de bodem van het putje ligt. Incubeer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Dit protocol kan worden uitgevoerd met behulp van E 15 muiscortex of E 18 rattenhippocampi.

In deze demonstratie worden muiscortex gebruikt. Plaats de cortex van een halve nest of één nest embryo's op ijs in een een milliliter einor die PBS met calcium en magnesium bevat en plaats ze op ijs. Vervolgens, met behulp van een een milliliter micropipet, verwijder je het PBS van het corticale weefsel.

Voeg vervolgens 500 microliter van een Pappa DNA's een oplossing toe aan het corticale weefsel van een halve nest embryo's. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 15 tot 20 minuten. Tweemaal tijdens de incubatieperiode, schud je zachtjes het buisje om de inhoud te mengen. Na de incubatie, gebruik je een vlam gepolijste gesiliconiseerde pasterpipet om het weefsel zachtjes 10 tot 15 keer te rerateren totdat celdispersie is verkregen.

Er mogen weinig of geen brokken niet-gedissocieerd weefsel achterblijven, vermijd het genereren van luchtbellen. Leg de gedissocieerde celsuspensie voorzichtig over een drie milliliter kussen van 4%BS, A in Hank's BSS met additieven. Vervolgens centrifugeert u in een tafelcentrifuge met een swing-out rotor gedurende zeven minuten bij 100 keer G.

Na het draaien verwijder je voorzichtig het supernatant, zorg ervoor dat je de celpelleti niet aspireert. Voeg vervolgens een milliliter compleet neuro basaal medium toe, pipet voorzichtig op en neer om de gepelletiseerde cellen te hersuspenderen. Gebruik vervolgens een hemo cytometer om de concentratie levende cellen te bepalen.

Alleen faseheldere cellen moeten als levend worden beschouwd onmiddellijk voorafgaand aan het plateren. Aspireer de overtollige laminine-serumoplossing van de dekglasjes in de putjes en vervang deze door primaire neuronkweekmedium. Voeg vervolgens 75.000 tot 100.000 primaire neuronen toe aan elk putje.

Kweek de neuronen maximaal 21 dagen in neuro basaal medium bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide. Op dag zeven en elke week daarna, voeg je anti-mitotisch fluoro, deoxy uridine uridine toe om gliale overgroei te voorkomen en voer je een half medium verversing uit. Tijdens de eerste week in cultuur ontwikkelen neuronen dendritische arbors zoals te zien is in deze afbeelding van een twee dagen oude cultuur. Tegen de tweede tot derde week zijn ze volwassen en zullen ze synaptogenese ondergaan.

Een uitgebreid netwerk van projecties wordt geïllustreerd in deze figuur genomen op 14 dagen in vitro. Om oppervlakte-eiwitten van belang te labelen, voeg je het primaire antilichaam rechtstreeks toe aan het geconditioneerde medium bij de juiste concentratie. Elke conditie moet in drievoudige replica worden getest. Vier controles, pre-immune serum of antilichamen die intracellulaire gebieden van het eiwit herkennen die niet worden blootgesteld tijdens exocytose, kunnen worden gebruikt bij dezelfde verdunning als het primaire testantilichaam. Breng de cellen terug naar de kweekincubator gedurende één, twee of vier uur na de incubatie. Aspireer het antilichaambevattende medium, was de putjes eenmaal voorzichtig maar snel met PBS.

Voeg kamertemperatuur toe door oplossing toe te voegen aan de putjes, dan te aspireren. Voeg vervolgens vers bereide 4% paraformaldehyde toe en incubeer gedurende vijf minuten. Voeg kamertemperatuur toe om de cellen te fixeren na fixatie.

Verwijder de paraformaldehydeoplossing uit de putjes en gooi deze weg in een vloeibaar afvalcontainer in de afzuigingskast. Spoel vervolgens de cellen snel drie keer met PBS zoals eerder. Laat de derde spoeling op zijn plaats zodat het dekglas gemakkelijk kan worden verwijderd.

Gebruik vervolgens pincetten om de dekglasjes voorzichtig uit de plaat te verwijderen en plaats ze met de celzijde naar boven op een velletje param op de bodem of het deksel van een wegwerpcultuurplaat. De rest van het kleuringsprotocol wordt uitgevoerd op dit oppervlak. Pipet voorzichtig blokkeeroplossing van PBS 5%BSA op de cellen om een ronde, belvormige druppel op het dekglas te maken, zodat deze niet uitdroogt. Incubeer gedurende 30 minuten.

Het is belangrijk om te onthouden dat u geen detergent aan de blokkeeroplossing mag toevoegen. In dit stadium mogen de cellen niet worden gepermeabiliseerd wanneer alleen celoppervlakte-eiwitten moeten worden gelabeld. Na het blokkeren, aspireer je de blokkeeroplossing,