Microschaal-Vortex bijgestaan Electroporatie voor Sequential Molecular Delivery
7 augustus 2014
Een microfluïdische vortex bijgestaan elektroporatie platform is ontwikkeld voor sequentiële levering van verschillende moleculen in dezelfde cel populaties met een nauwkeurige en onafhankelijke dosering controle. Het systeem afmeting gebaseerd doelcel zuiveringsstap voorgaande elektroporatie geholpen om moleculaire levering efficiëntie en verwerkt levensvatbaarheid van de cellen te verbeteren.
Het algemene doel van deze procedure is om verschillende soorten biologisch zinvolle moleculen op een sequentiële en doseerbaar controleerbare manier met hoge efficiëntie te leveren met behulp van de Vortex-geassisteerde microfluïdische porer. Dit wordt bereikt door eerst vier centrifugeerbuisjes van 50 milliliter afzonderlijk te bereiden met DPBS-oplossingen met cellen en biomoleculen, en elke buis aan zijn respectieve flesjeshouder te bevestigen die verbonden is met het pneumatische stroomregelsysteem. De tweede stap is om de inlaatslangen van elk respectief flesje in het microfluïdische apparaat met de ingebedde 15-pins elektroden in te brengen. Vervolgens worden de cellen in het apparaat gevoerd waar ze vast komen te zitten in microschaal voorwerpen die worden gevormd in de elektroporatiekamers.
De laatste stap is om korte elektrische pulsen toe te passen op de vastgezette cellen, onmiddellijk gevolgd door het injecteren van de oplossingen die de te leveren biomoleculen bevatten in de cytosol. Uiteindelijk kunnen de cellen die uit dit proces zijn verkregen worden vrijgegeven en verzameld voor downstream analyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat de voorgestelde techniek in staat is om op sequentiële wijze gecontroleerde hoeveelheden van meerdere moleculen af te leveren in een vooraf geselecteerde identieke celpopulatie met hoge efficiëntie en levensvatbaarheid.
Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, omdat de stappen voor vloeistofuitwisseling moeilijk te leren zijn omdat de timing van de koude stromingsstap bij elke oplossing. De wisselstap bepaalt de stabiliteit van de celvangst. Een metastatische borstkankercellijn M-D-A-M-B 2 31 zal worden gebruikt in dit experiment, één keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter in een volume van 10 milliliters per T 75 weefselkweekkolf in Leibovitz's L 15 medium gesupplementeerd met 10%volume per volume, foetaal bovien serum, en 1%penicilline.
Streptomycine bewaar de cellen in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius met een 0%koolstofdioxide omgeving. Twee dagen na het zaaien, oogst de cellen voor experimenten. Na het wassen van de cellen met bukos fosfaatgebufferde zoutoplossing of DPBS, behandel de cellen met 0,25% tripsine EDTA gedurende twee minuten.
Voeg acht milliliter groeimedium toe om de enzymatische activiteit te inactiveren, bezink de cellen door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 200 keer G en hersuspensieer het medium tot een eindconcentratie van vijf keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter. Het ontwerp en de fabricage van het microfluïdische elektroporatieapparaat worden niet in deze video getoond, maar worden beschreven in het bijbehorende manuscript. Het systeem bestaat uit inlaten voor cellen, moleculen en een spoeloplossing.
Twee rechte kanalen waar inertiefocusering plaatsvindt. 10 elektroporatiekamers met elektroden en een uitlaat om de stromingsexperimenten op te zetten. Plaats een uitlaat, polyether, ether ketone of piekbuis, en de 15-pins aluminium elektrode voor korte puls, hoge voltage toepassing op de aangewezen plaatsen via de gaten in het microkanaal.
De 15-pins elektrode bestaat uit 10 positieve en vijf negatieve elektroden. Elke positieve elektrode is 1,5 millimeter uit elkaar geplaatst van een negatieve elektrode, en elke elektrode van dezelfde polariteit is 1,35 millimeter uit elkaar geplaatst. Verbind de elektrische apparatuur voor het genereren van hoge voltage korte vierkante golfpulsen naar de aluminium elektroden die in contact zijn met stromende oplossingen.
In de PDMS-mal moet de apparatuur bestaan uit een pulsgenerator en een in-house gebouwde hoogspanningsversterker. Bereid vier 50 milliliter centrifugeerbuisjes afzonderlijk voor met DPBS en oplossingen met cellen en moleculen. Bevestig elke buis aan zijn respectieve flesjeshouder verbonden met het pneumatische stromingsregelsysteem.
Verbind de piekbuis van de inlaten van de flesjeshouders met de respectieve inlaatgaten in het microfluïdische apparaat. Vervolgens, stel de grootte van de vierkante golfpulsen in op 100 volt.
Om de elektrische veldsterkte over de elektroporatiekamer gelijk te hebben aan 0,7 kilovolt per centimeter. Stel de drukregelaar in op 40 PSIA, een enkelvoudige handmatig instelbare stikstofbron wordt gebruikt om alle steekproefbuisjes gelijkmatig te belasten en maakt gebruik van een hogesnelheidsverdeler om individuele oplossingspoorten tijdig te activeren. Gebruik de op maat gemaakte labview-software voor klepbesturing.
Open de labview-software met de label klepbesturing en klik op uitvoeren vanuit het vervolgkeuzemenu getiteld Werken. Klik op het overeenkomstige kleppictogramklep één om de klep voor het DPBS-reservoir te openen om de stromingssnelheid te primen die nodig is voor stabiele celvangst en voortwerpselgeneratie gedurende 1,5 minuten. Het kleppictogram zou van grijs naar groen moeten veranderen wanneer het is geactiveerd, stroming, zowel wassen als celoplossingen tegelijkertijd door het apparaat voor 10 seconden voorafgaand aan de celvangststap.
Om een ononderbroken stroming tijdens de oplossingswisselstap te waarborgen, moet deze korte co-stromingsstap bij elke oplossingswisselstap worden herhaald. Schakel de actieve oplossingspoort om van de wasoplossing naar de celoplossing om cellen in de elektroporatiekamer gedurende 30 seconden te vangen. In deze video vertegenwoordigen de blauwe fluorescente signalen levensvatbare haken.
3, 3, 3, 4, 5 fasecellen. Schakel de waspoort in en spoel het apparaat gedurende 20 seconden. Om niet-vastgezette verontreinigende cellen te verwijderen, stroom de oplossing die het eerste molecuul van belang bevat.
Propidiumjodide in het apparaat voor visualisatiedoeleinden. In deze demonstratie worden nucleïnezuurkleuren gebruikt in plaats van fluorescent gelabelde DExT-strengen vanwege de superieure verhouding van het geluid tot signaal van de kleuren. Pas vijf korte pulsen toe onmiddellijk na injectie van de moleculaire oplossing, bewaak de grootte en het aantal van de toege
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Een microfluïdisch platform voor vortex-ondersteunde elektroporatie maakt de sequentiële aflevering van meerdere moleculen in identieke celpopulaties mogelijk met nauwkeurige doseringscontrole. Deze methode verbetert de efficiëntie van de moleculaire aflevering terwijl de celviabiliteit behouden blijft.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microfluidica
- Elektroporatie
- Celbiologie
Achtergrond
- Elektroporatie is een techniek die wordt gebruikt om moleculen in cellen te introduceren.
- Microfluïdische apparaten maken een nauwkeurige controle van de vloeistofstroom en celmanipulatie mogelijk.
- Sequentiële toediening van biomoleculen kan de experimentele resultaten verbeteren.
- Het behouden van de celviabiliteit tijdens het proces is cruciaal voor downstream-applicaties.
Doel van de studie
- Een platform ontwikkelen voor de gecontroleerde afgifte van meerdere biomoleculen.
- De efficiëntie van de moleculaire afgifte in cellen verbeteren.
- Een hoge cellevensvatbaarheid na electroporatie garanderen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van DPBS-oplossingen met cellen en biomoleculen.
- Gebruik van een pneumatisch stroomcontrolesysteem voor vloeistoftoevoer.
- Vorming van microscale vortices in elektroporatiekamers.
- Toepassing van korte elektrische pulsen om moleculaire opname te vergemakkelijken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle aflevering van meerdere biomoleculen in cellen.
- Hoge efficiëntie en levensvatbaarheid van de bewerkte cellen.
- Aangetoonde capaciteit voor sequentiële en gecontroleerde dosering.
- Potentieel voor downstream-analyse van de behandelde cellen.
Conclusies
- Het ontwikkelde platform biedt een aanzienlijke vooruitgang in moleculaire afleveringstechnieken.
- Het maakt nauwkeurige controle mogelijk over de dosering en timing van de aflevering van biomoleculen.
- Deze methode kan worden toegepast in diverse biologische studies waarbij een hoge celviabiliteit vereist is.
Veelgestelde Vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit microfluidische electroporatieplatform voorziet in de behoefte aan nauwkeurige, sequentiële afgifte van meerdere biomoleculen in homogene celpopulaties, een cruciale capaciteit voor het screenen van combinatietherapieën en mechanische risicobeperking in vroege ontdekkingsfasen. Door real-time visualisatie en in situ parameteraanpassingen mogelijk te maken, verhoogt het systeem het voorspellende vertrouwen in de efficiëntie van de moleculaire opname terwijl een hoge levensvatbaarheid behouden blijft, wat betrouwbare go/no-go beslissingen ondersteunt in workflows voor targetvalidatie. Het vermogen van de technologie om geladen en neutrale macromoleculen met een consistente efficiëntie (>70%) over verschillende molecuulgewichten af te leveren, biedt een schaalbare, reproduceerbare basis voor assay-ontwikkeling in oncologisch en farmacologisch onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar combinatorische moleculaire effecten op gemetastaseerde borstkankercellen door middel van sequentiële, doseringsgestuurde afgifte van dextranmoleculen met variërende grootte en lading.
- Operationele waarde: Isoleert uniforme celpopulaties via microscale vortices, waardoor de variabiliteit in elektroporatie-efficiëntie wordt verminderd en de reproduceerbaarheid tussen herhalingen wordt verbeterd.
- Voorspellende waarde: Real-time fluorescentiemonitoring maakt onmiddellijke optimalisatie van pulsparameters mogelijk, wat de afgifte-efficiëntie en datakwaliteit voor daaropvolgende functionele assays verbetert.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Vergemakkelijkt de bereiding van gestandaardiseerde, geëlectroporeerde celmonsters die geschikt zijn voor kwantificering van moleculaire opname via flowcytometrie, wat robuuste assay-resultaten mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Integreert pneumatische stroomregeling en klepautomatisering voor een consistente vloeistofuitwisseling, wat high-throughput campagnes voor sequentiële molecuultoediening ondersteunt.
- Schaalbaarheid: Het ontwerp van het platform maakt hergebruik over meerdere experimentele runs mogelijk met minimale variatie, wat bijdraagt aan assay-standaardisatie op bedrijfsniveau.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Handhaaft een hoge cellevensvatbaarheid na electroporatie, waardoor de herstelde cellen geschikt zijn voor downstream-analyse zoals flowcytometrie en functionele validatie.
- Mechanische Risicoreductie: Maakt gecontroleerde tests van moleculaire combinaties mogelijk om synergetische of antagonistische effecten te beoordelen, waardoor de onzekerheid bij de selectie van de leidende combinaties wordt verminderd.
- Predictieve Betrouwbaarheid: Een aangetoonde afleveringsefficiëntie van >70% voor zowel 3.000 als 70.000 Da dextranmoleculen ondersteunt een betrouwbare extrapolatie naar therapeutische macromoleculen in preklinische modellen.
Integratie van pipeline en workflow
Het platform past binnen het continuüm van ontdekking, van targetvalidatie tot leadidentificatie, waarbij sequentiële afgifte van biomoleculen een systematische evaluatie mogelijk maakt van combinatie-effecten op ziekterelateerde systemen.
- Discovery Biology: Ondersteunt het testen van hypothesen over moleculaire synergie door nauwkeurige, sequentiële toediening van probes aan identieke celpopulaties onder gecontroleerde omstandigheden mogelijk te maken.
- Screening: Levert kwantitatieve, op fluorescentie gebaseerde opnamegegevens die vergelijking van de moleculaire efficiëntie over verschillende fysisch-chemische eigenschappen mogelijk maken.
- Analytics: Genereert meetbare resultaten (opname-efficiëntie, fluorescentie-intensiteit) die geschikt zijn voor statistische analyse en de selectie van hits in screeningcampagnes.
- Translationeel onderzoek: Behoudt de celintegriteit voor functionele assays, waardoor bevindingen uit de discovery-fase kunnen worden overbrugd naar preklinische evaluatie van moleculaire combinaties.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Ontworpen als een modulair fluïdisch systeem dat aanpasbaar is aan diverse biomoleculen en celtypen, wat herhaaldelijk gebruik in verschillende projecten ondersteunt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit in combinatiestudies door gecontroleerde, sequentiële toediening van meerdere agentia aan uniforme celpopulaties mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via nauwkeurige flowcontrole, vortex-gebaseerde trapping en real-time visualisatie, waardoor operatorafhankelijke variabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door het succespercentage van moleculaire toedieningsexperimenten te verhogen, wat verspilling van reagentia en mislukte runs vermindert.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van moleculaire combinaties mogelijk op basis van gevalideerde gegevens over toedieningsefficiëntie en cellulaire respons.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de bediening van microfluïdische systemen, hoogspanningspulsgeneratie en fluorescentiemicroscopie voor real-time monitoring.
- Is afhankelijk van pneumatische stroomregelsystemen, pulsgeneratoren, hoogspanningsversterkers en oscilloscopen voor nauwkeurige elektrische en fluïdische controle.
- Noodzaak tot standaardisatie van kleptiming, drukinstellingen en pulsparameters tussen gebruikers om reproduceerbare vortexvorming en electroporatie-efficiëntie te garanderen.
- Aanpassing aan verschillende celtypen kan optimalisatie van stroomsnelheden, retentietijd en pulsparameters vereisen, op basis van celgrootte en membraaneigenschappen.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak voor zorgvuldige hantering van hoogspanningscomponenten en potentiële schuifspanning op gevoelige celtypen tijdens de vortexvorming.
