Elektriciteit-Free, Sequential nucleïnezuur en eiwit isolatie
15 mei 2012
Een instrument en chemicaliën beschreven sequentieel isoleren nucleïnezuren gevolgd door eiwitten van een monster zonder electriciteit. De tool bestaat uit een sorptiemiddel gehouden binnen een transferpipet, terwijl de isolatie chemie zijn gebaseerd op de vaste-fase-extractie principes. De geïsoleerde macromoleculen kan geanalyseerd worden door immuno-gebaseerde en PCR-gebaseerde assays.
Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van PCR-klare nucleïnezuren en immunoreactieve eiwitten uit een monster, zonder dat daar elektriciteit of laboratoriuminfrastructuur voor nodig is. De isolatie van nucleïnezuren en eiwitten begint met het mengen van het monster met guanidine en thiocyanaat om het monster te lyseren, waarna het mengsel door het sorbent in de extractiepipet wordt geleid. Na de vijfde en laatste passage over het sorbent wordt het mengsel overgebracht naar de eiwitextractiebuffer en opzij gezet voor het isoleren van het immunoreactieve eiwit.
Vervolgens worden het sorbent en de gebonden nucleïnezuren gewassen door 95% ethanol over het sorbent te leiden. De sorbent en gebonden nucleïnezuren worden vervolgens meerdere malen gedroogd door gedurende vijf minuten omgevingslucht over het sorbent te leiden. De laatste stap voor de isolatie van PCR-klare nucleïnezuren is het elueren van de nucleïnezuren van het sorbent met behulp van 250 µL tris of een andere soortgelijke waterige oplossing voor isolatie van het immunoreactieve eiwit.
Nadat het monster en de eiwitextractiebuffer zijn gemengd, wordt een tweede extractiepipet gebruikt om het mengsel 15 keer over het sorbent te leiden. De volgende stap is het wassen van het sorbent met het gebonden eiwit door herhaaldelijk 95% ethanol over het sorbent te leiden. Vervolgens worden het sorbent en het gebonden eiwit gedroogd door gedurende vijf minuten omgevingslucht over het sorbent te leiden.
De laatste stap van het protocol is het elueren van het eiwit uit het sorbent. Uiteindelijk maakt de extractiepipet die in deze procedure wordt gebruikt, de isolatie van PCR-klare nucleïnezuren en immunoreactieve eiwitten mogelijk zonder gebruik van elektriciteit. Hallo, mijn naam is Dave Pawlowski.
Ik ben senior onderzoeker bij Kubrick Incorporated in Buffalo, New York, en vandaag gaan we een techniek leren waarmee zowel eiwitten als nucleïnezuren in één proces worden geïsoleerd, zonder dat daarvoor een centrifuge, een vortexmixer of andere extra laboratoriumapparatuur nodig is. Zorg ervoor dat de monsters in vloeibare vorm zijn voordat u overgaat tot lysering van het monster. Indien het monster solide is, bijvoorbeeld voedsel of feces, moet het monster worden gesuspendeerd in een vloeibaar medium zoals water of fosfaatgebufferde zoutoplossing.
Meng 500 µL van het monster met 500 µL guanidine thiocyanaat 6 M in een buisje van 1,5 mL. Druk vervolgens op het reservoir van een extractiepipet om de aanwezige lucht te verdrijven. Trek het volledige monster van 1 mL door het absorberende materiaal in de extractiepipet door het reservoir langzaam te laten uitzetten.
Keer het extractie-instrument om zodat de sorbentiaalkrallen en het monster in de bulb lopen. Maal de sorbentiaalkrallen samen met het monster in de bulb. Zorg er hierbij voor dat het monster niet uit de extractiepipet wordt gestuwd.
Keer de extractiepijpet om en breng het monster terug in de oorspronkelijke buis van 1,5 milliliter. Trek het volledige monster van één milliliter in de extractiepijpet, waarbij u met een matig tempo over het sorbiens gaat. Zorg ervoor dat het sorbiens in de hals van de extractiepijpet blijft en breng het volledige monster door op de peer te drukken terug in de buis van 1,5 milliliter.
Herhaal dit proces door het monster nog vier keer over het sorbent te leiden, voor een totaal van vijf passes. Na de vijfde pass over het sorbent wordt het volledige monster van 1 milliliter uitgestoten in 4 milliliter proteïne-extractiebuffer in een conische buis van 15 milliliter. Meng de buis door deze om te keren, sluit de buis vervolgens en zet deze opzij voor later gebruik.
Was de geïsoleerde nucleïnezuren door drie keer één milliliter 95%ethanol over het sorbent te laten lopen, waarbij de ethanol telkens wordt teruggebracht in de oorspronkelijke buis. Herhaal deze wasstap na de laatste passage nog drie keer met een tweede milliliter 95%ethanol. De volgende stap van de procedure is het drogen van het sorbent; het herstel van de nucleïnezuren verloopt het beste wanneer het sorbent droog is.
Ik weet dat deze stap tijdrovend is. Echter, als u deze stap binnen het aanbevolen tijdsbestek voltooit, zullen uw resultaten beter zijn. Knijp vijf minuten lang herhaaldelijk in de peer.
Sla omgevingslucht door de extractiepipet om de nucleïnezuren en het sorbentbed te drogen, en veeg resterende ethanol van de punt van de extractiepipet af. Herwin de nucleïnezuren door met een Kim wipe vijf keer 250 µL 10 mM Tris over het sorbent te leiden.
De resulterende oplossing bevat de geëxtraheerde nucleïnezuren. Om eerst eiwitextractie uit te voeren, mengt u het monster door de buis om te keren in de proteïne-extractiebuffer die eerder apart was gezet. Breng ongeveer twee tot drie milliliter van dit monster van vijf milliliter over de sorbent van een nieuwe extractiepipet. Pipetteer het gehele monster in dezelfde conische buis van 15 milliliter. Let er hierbij op dat de sorbent in de hals van de extractiepipet blijft.
Herhaal dit proces door het monster 15 keer over het sorbent te leiden. Was het sorbent en het gebonden eiwit door drie keer één milliliter 95%Ethanol over het sorbentbed te leiden, waarbij de ethanol in de oorspronkelijke buis wordt opgevangen; was vervolgens drie keer opnieuw met een tweede milliliter 95%ethanol.
De volgende stap van de procedure is om het sorbent opnieuw te drogen. Net als bij nucleïnezuren wordt de eiwitrecovery het best uitgevoerd wanneer het sorbent gedurende een langere periode is gedroogd.
Druk vijf minuten lang op de peer en laat deze weer los, zodat er omgevingslucht door de extractiepipet stroomt. Veeg het resterende ethanol van de punt van de extractiepipet af om het eiwitsorbensbed te drogen. Herwin het eiwit door met een Kim wipe vijfmaal 250 µL PBS over het sorbens te leiden.
De PBS-buffer kan worden vervangen door elke andere geschikte waterige oplossing, zoals 10 millimolair tris, pH 6,8. De resulterende oplossing bevat het eiwitgehalte van het monster. De shiga-toxinegenen geassocieerd met enterohemorragische E. coli O157:H7 stam EDL933 werden geamplificeerd vanuit een nucleïnezuur-eiwitextractieprocedure met gebruik van de extractiepipet.
De shiga-toxinegenen, shiga-toxine één en shiga-toxine twee, bevinden zich op temperaat lambda-achtige bacteriofagen en defecte bacteriofagen onder controle van de PR-promotor. De activatie van de SOS-respons in E. coli leidt tot profagen-inductie en/of toxineproductie. In dit geval is er een aanzienlijke toename in de amplificatie van het shiga-toxine twee-gen wanneer de SOS-respons wordt geïnduceerd door mitomycine C in vergelijking met de onbehandelde controle.
Dit wijst op pro-faaginductie en replicatie van het faaggenoom. Het eiwit dat is teruggewonnen uit de experimenten voor de isolatie van nucleïnezuren en eiwitten, zoals beschreven in de video, is immunoreactief. De geïsoleerde eiwitfractie is aangebracht op de Rapid Check E. coli O157 lateral flow-teststrips.
Controles vertonen een positieve identificatie in alle monsters die e coli oh 1 5 7 bevatten, met of zonder Shigatoxine-inductie, zoals gevisualiseerd door de aanwezigheid van twee rode banden. De gegevens tonen daarnaast positieve resultaten voor die monsters met e coli oh 1 5 7 waarbij nucleïnezuren en eiwitten zijn verwerkt met behulp van de extractiepipet. Deze gegevens tonen aan dat het geïsoleerde eiwit uit elk monster immuunoactief is en hiermee een positieve respons uitlokt.
Het geïsoleerde eiwit is geschikt voor elektroforese, zoals hier afgebeeld in een met kumasi gekleurde 8% acrylamidegel geladen met BSA, geïsoleerd uit zes molaire gudina-isothiocyanaat. Met gebruik van de extractie, de pipet en het bijbehorende protocol is de elektroforetische mobiliteit van het geïsoleerde eiwit identiek aan die van de controlemonsters. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in minder dan 20 minuten worden uitgevoerd.
Na het bekijken van deze video heeft u een duidelijk inzicht gekregen in hoe u eiwitten en nucleïnezuren uit het eenvoudige apparaat kunt isoleren. Bedankt voor uw tijd en het bekijken van onze video.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een nieuwe tool en chemische methoden voor de sequentiële isolatie van nucleïnezuren en eiwitten uit monsters zonder elektriciteit. De methode maakt gebruik van een sorptiemiddel in een overdrachtpipet, waarbij solid-phase extractieprincipes worden toegepast voor effectieve isolatie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Moleculair biologie
- Analytische chemie
Achtergrond
- Traditionele methoden voor het isoleren van nucleïnezuren en eiwitten vereisen vaak elektriciteit en gespecialiseerde apparatuur.
- Deze studie presenteert een elektriciteit-vrije alternatief voor monsterverwerking.
- De methode is toepasbaar op verschillende monstersoorten, inclusief vaste monsters.
- Maakt gebruik van guanidinethiocyanaat voor monsterlyse.
Doel van studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het isoleren van PCR-klare nucleïnezuren en immunoreactieve eiwitten.
- Om de noodzaak voor laboratoriuminfrastructuur tijdens het isolatieproces te elimineren.
- Om een gebruiksvriendelijk protocol te bieden dat in veldcondities kan worden uitgevoerd.
Gebruikte methoden
- Monsterlyse met guanidinethiocyanaat.
- Sequentiële doorvoer van monsters over een sorptiemiddel in een extractiepipet.
- Wassen van gebonden nucleïnezuren en eiwitten met ethanol.
- Elutie van nucleïnezuren en eiwitten met behulp van waterige oplossingen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van nucleïnezuren en eiwitten zonder elektriciteit.
- Protocol maakt extractie van PCR-klare nucleïnezuren mogelijk.
- Immunoreactieve eiwitten werden effectief geïsoleerd voor verdere analyse.
- Toepasselijkheid op verschillende monstersoorten, inclusief vaste monsters, is aangetoond.
Conclusies
- De ontwikkelde methode biedt een praktische oplossing voor de isolatie van nucleïnezuren en eiwitten.
- Het is geschikt voor gebruik in omgevingen met beperkte middelen.
- Deze aanpak kan onderzoek in diverse biologische velden vergemakkelijken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Electricity-free, sequential nucleic acid and protein isolation enables rapid, field-based molecular analysis where laboratory infrastructure is unavailable. This capability supports early pathogen detection, dual biomarker validation, and streamlined sample logistics in resource-limited or decentralized settings. The approach enhances predictive confidence by allowing direct genomic and proteomic corroboration from a single sample, reducing ambiguity at critical discovery and diagnostic inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven interrogation of infectious agents in diverse environments.
- Supports functional target validation by providing both nucleic acid and protein outputs from the same sample.
- Facilitates mechanistic de-risking through multi-modal biomarker analysis.
Screening & Assay Development
- Prepares validated nucleic acid and protein extracts for downstream PCR and immunoassay workflows.
- Improves assay reproducibility by minimizing sample handling and split-sample variability.
- Enables rapid, scalable screening in field or low-resource settings.
Translational & Preclinical Research
- Aligns field-collected samples with translational biomarker strategies by supporting both genomic and proteomic readouts.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving sample integrity and analytical flexibility.
- Reduces risk of false negatives by enabling redundant molecular confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, field diagnostics, and preclinical validation by enabling robust sample collection and dual-analyte extraction outside traditional labs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking for pathogen and biomarker identification.
- Screening: Delivers assay-ready nucleic acids and proteins for immediate or deferred analysis.
- Analytics: Provides quantitative, corroborative outputs for cross-platform comparison and decision-making.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and sample continuity from field to lab.
- Enterprise Reuse: Offers a portable, reusable extraction platform adaptable to multiple sample types and workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity by enabling dual molecular analysis.
- Operational Value: Standardizes extraction protocols and eliminates dependency on electricity or specialized equipment.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency in decentralized or resource-limited settings.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling robust, field-compatible sample analysis.
Implementation Considerations
- Requires basic molecular biology expertise for sample handling and extraction steps.
- Minimal instrumentation needed; relies on proprietary extraction pipettes and standard buffers.
- Cross-team standardization is facilitated by unified protocols for nucleic acid and protein isolation.
- Adaptable to a wide range of sample types, including liquids and solids suspended in buffer.
- Throughput is limited by manual processing; best suited for rapid, point-of-care, or low-to-moderate volume applications.
