Een nieuwe strategie combinatie matrix-CGH, geheel-exome Sequencing en In Utero Electroporation bij knaagdieren ter identificatie van de oorzakelijke genen voor hersenen misvormingen
1 december 2017
Nodulair heterotopia van de Periventricular (PNH) is de meest voorkomende vorm van misvorming van corticale ontwikkeling (MCD) in volwassenheid maar haar genetische basis blijft onbekend in meest sporadische gevallen. Onlangs hebben we een strategie nieuwe kandidaat om genen te identificeren voor MCDs en direct bevestigen hun oorzakelijke rol in vivo.
Het algemene doel van deze procedure is om nieuwe kandidaatgenen voor hersenmisvormingsstoornissen te identificeren en hun oorzakelijke rol direct in-vivo te bevestigen. Deze strategie kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurobiologie door moleculaire paden te ontdekken die verband houden met hersenontwikkeling en gecorreleerde pathologieën. Het grote voordeel van deze strategie is dat het zal helpen bij het ontdekken van nieuwe genen die geassocieerd zijn met hersenaandoeningen en bij het ontwikkelen van nieuwe diagnostische hulpmiddelen.
Met behulp van deze aanpak konden we de cruciale bijdrage van het C6orf70-gen in de pathogenese van periventriculaire nodulaire heterotopie onthullen, een hersenmisvorming veroorzaakt door abnormale neuronale migratie. Het demonstreren van de procedure zal Fabienne Schaller zijn, een ingenieur uit ons laboratorium. Bereid een zwangere E15-rat voor op de procedure zoals beschreven in het schriftelijke protocol en volgens institutionele en nationale richtlijnen.
Zorg ervoor dat het dier goed verdoofd is, dat oogzalf op de ogen wordt aangebracht en dat de buik goed geschoren en gedesinfecteerd is. Na het maken van een twee centimeter verticale insnijding in de huid en de spier van de caudale buikmiddenlijn met scherpe schaar, legt u voorzichtig één baarmoederhoorn bloot uit de buikholte. Breng druppels van 37 graden Celsius voorverwarmde zoutoplossing aan om de embryo's te bevochtigen.
Houd de baarmoeder vochtig gedurende de hele procedure. Om DNA te injecteren, houdt u voorzichtig een embryo in één hand met de kop gemakkelijk toegankelijk. Breng vervolgens met de andere hand voorzichtig een glazen capillair, verbonden met een microinjector, in de linkerlaterale ventrikel in, die zich op één millimeter van de middenlijn en op een diepte van twee tot drie millimeter bevindt.
Gebruik de microinjector om ongeveer één microliter DNA met fast green te injecteren om visuele monitoring van de injectie mogelijk te maken. Om de DNA in de cellen te elektroporeren, brengt u eerst zoutoplossing aan op het oppervlak van de drie bij zeven millimeter elektrode. Plaats vervolgens de positieve elektrode op de geïnjecteerde kant en de negatieve elektrode op de niet-geïnjecteerde rechterventrikel.
Gebruik de voetgestuurde pedaal om vijf elektrische pulsen met intervallen van 950 milliseconden te leveren. Na elektroporatie, brengt u de baarmoederhoorn terug in de buikholte en voegt u steriele zoutoplossing toe om de embryo's meer natuurlijk te positioneren en om rekening te houden met intraoperatieve vochtverliezen. Sluit de spierwand met resorbeerbare chirurgische hechtingen, vervolgens de huid met een eenvoudige onderbroken hechting.
Zorg voor postoperatieve pijnstilling gedurende maximaal 48 uur of zoals aangegeven in institutionele richtlijnen. Breng de rat terug naar zijn schone thuiskooi en bewaak hem totdat hij uit de anesthesie ontwaakt. Na het fixeren van de hersenen in 4% paraformaldehyde zoals beschreven in het schriftelijke deel van het protocol, was in PBS gedurende 10 minuten.
Tijdens het wassen, bereidt u 50 milliliter 4% agar in PBS voor en zorg ervoor dat de temperatuur van de opgeloste agarose niet hoger is dan 50 graden Celsius. Giet de agarose in plastic inbeddingsvormen en plaats vervolgens de hersenen in de agarose. Plaats de ingebedde hersenen bij vier graden Celsius en laat de agarose gedurende ten minste een uur polymeriseren.
Nadat de agarose is gepolymeriseerd, snijdt u overtollig agarose rond de hersenen weg en lijmt u de hersenen met de voor-achter toegang van de hersenen loodrecht op de mesrand op de vibratomebasisplaat. Wacht een paar minuten totdat de lijm droog is en plaats de plaat met de gelijmde hersenen in de vibratomekamer. Vul de vibratome met PBS en begin met het snijden van 100 micron dikke secties.
Na het snijden, brengt u de secties over naar microscoopglazen en verwijdert u overtollig vocht. Voeg vervolgens een paar druppels montagemedium toe en plaats een dekglas bovenop de secties. Laat overnacht drogen.
Beeld de secties af met 10x vergroting op een laserscanning confocale microscoop. Om de beelden te analyseren, converteert u het beeld eerst in 8-bit met behulp van geschikte software voor kwantitatieve beeldanalyse. Selecteer vervolgens een representatieve GFP-positieve fluorescente cel en definieer handmatig de vorm ervan door op schatting te klikken en het vrijhandselectiegereedschap te gebruiken om de rand van de cel te tekenen.
De software behoudt automatisch de diameter en intensiteitsdrempel van de cel. Klik op cellen vinden om de software toe te laten getransfecteerde cellen in de gehele cortex te lokaliseren. Verwijder vervolgens, indien nodig, handmatig vals positieven.
Verdeel de volledige dikte van de cortex in acht gebieden van belang, genormaliseerd in individuele secties, door te klikken op region tool, selecteer acht streepjes, waarbij streepjes één en acht respectievelijk overeenkomen met de ventrikelzone en de bovenkant van de corticale plaat. Klik vervolgens op toepassen om de software de relatieve positie van GFP-getransfecteerde cellen in de hele cortex te laten tellen. Klik ten slotte op opslaan kwantificering om gegevens te exporteren in een Excel-bestand voor analyse.
Array CGH en volledige exoomsequencing identificeerden C6orf70 als een kandidaatgen voor ontwikkelingsgenafwijkingen. Kwantitatieve PCR bepaalde dat dit gen, samen met PHF10 en DLL1, wordt tot expressie gebracht in de cerebrale cortex van ratten. De volgende afbeeldingen tonen representatieve neocorticale coronale secties van E20-rattenhersenen 5 dagen na elektroporatie met alleen groen fluorescent eiwitconstruct of in combinatie met shRNA die het C6orf70-coderende sequentie target of met de relatief ineffectieve mismatchconstruct.
Filament A knock down werd gebruikt als controle van verminderde neuronale migratie. In-utero elektroporatie met shRNA die het C6orf70 of Filament A target, induceerde arrestatie van GFP-positieve cellen binnen de ventrikelzone, zoals aangegeven door de witte pijlen, terwijl de cellen die alleen GFP uitdrukken, of in combinatie met de mismatchconstruct, de neuronale migratie niet veranderden. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om in gedachten te houden welke toestand van corticale
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op het identificeren van nieuwe kandidaatgenen geassocieerd met periventriculaire nodulaire heterotopie (PNH), een veelvoorkomende malformatie van de corticale ontwikkeling. Het onderzoek heeft tot doel de causale rol van deze genen in vivo te bevestigen, waardoor ons begrip van hersenmalformaties wordt vergroot.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurobiologie
- Genetica
- Hersenontwikkeling
Achtergrond
- Periventriculaire nodulaire heterotopie is een veelvoorkomende vorm van malformatie van de corticale ontwikkeling bij volwassenen.
- De genetische basis van de meeste sporadische gevallen blijft grotendeels onbekend.
- Het identificeren van kandidaatgenen kan leiden tot betere diagnostische instrumenten.
- Het begrijpen van moleculaire pathways is cruciaal voor de aanpak van ontwikkelingsstoornissen van de hersenen.
Doel van de studie
- Om nieuwe kandidaatgenen voor hersenmisvormingsstoornissen te identificeren.
- Om de causale rol van deze genen in vivo te bevestigen.
- Om het begrip van moleculaire pathways die gerelateerd zijn aan de hersenontwikkeling te vergroten.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van E15 drachtige ratten voor experimentele procedures.
- Toepassing van een nieuwe strategie om kandidaatgenen te identificeren.
- In vivo bevestiging van genfunctie.
- Naleving van institutionele en nationale richtlijnen tijdens de procedure.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van de rol van het C6orf70-gen in de pathogenese van PNH.
- Demonstratie van de procedure door laboratoriumtechnicus Fabienne Schaller.
- Potentieel voor de ontwikkeling van nieuwe diagnostische hulpmiddelen op basis van de bevindingen.
- Inzichten in abnormale neuronale migratie geassocieerd met PNH.
Conclusies
- De studie identificeert succesvol sleutelgenen die gekoppeld zijn aan hersenmisvormingen.
- In vivo bevestiging van genfuncties is essentieel voor het begrijpen van PNH.
- Bevindingen kunnen leiden tot verbeteringen in diagnostische methodologieën.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
De integratie van array-CGH, whole-exome sequencing en in utero electroporatie maakt een systematische identificatie en functionele validatie mogelijk van causale genen voor hersenmalformaties. Deze workflow vult een kritisch gat in de koppeling van genomische bevindingen aan in vivo biologische mechanismen, wat de voorspellende zekerheid bij de selectie van targets voor neuro-ontwikkelingsstoornissen ondersteunt. De aanpak verbetert de besluitvorming binnen portfolio's door direct bewijs te leveren van genfuncties in ziekterelevante systemen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe ondervraging van de functie van kandidaatgenen in vivo mogelijk voor mechanistische risicoreductie.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door genomische veranderingen te koppelen aan fenotypische resultaten.
- Faciliteert de prioritering van genetische targets voor verdere therapeutische exploratie.
Screening & assayontwikkeling
- Stelt gevalideerde knaagdiermodellen vast voor downstream screening van genetische of farmacologische interventies.
- Biedt kwantitatieve, reproduceerbare readouts van neuronale migratie en corticale ontwikkeling.
- Maakt standaardisatie van fenotypische assays mogelijk voor vergelijkbaarheid tussen studies.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt preklinische modellen uit met menselijke ziektefenotypes voor de ontwikkeling van translationele biomarkers.
- Ondersteunt de continuïteit van genetische ontdekking naar in vivo functionele validatie.
- Vermindert het translationele risico door causaliteit te bevestigen in ziekterelevante systemen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze geïntegreerde strategie slaat een brug tussen genomische ontdekking en in vivo validatie, waardoor het zich bevindt op het grensvlak van vroege ontdekking en preklinisch onderzoek naar neuro-ontwikkelingsstoornissen.
- Discovery Biology: Koppelt de identificatie van kandidaatgenen aan functionele pathway-analyse in knaagdiermodellen.
- Screening: Levert kwantitatieve, regio-specifieke metingen van neuronale migratie voor assay-gereedheid.
- Analytics: Biedt statistische outputs en positionele kwantificering om genetische perturbaties te vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Stemt fenotypes van diermodellen af op klinische beeldvormingsresultaten voor biomarker-relevantie.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een modulaire workflow die aanpasbaar is aan diverse gentargets en fenotypes van hersenmisvormingen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie en vermindert mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Standaardiseert in vivo functionele assays en ondersteunt de reproduceerbaarheid tussen teams.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door direct bewijs te leveren van de causaliteit tussen gen en ziekte.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van genetische targets voor neurodevelopmentale indicaties mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in in utero electroporatie bij knaagdieren en kwantitatieve beeldanalyse.
- Vereist toegang tot infrastructuur voor genomische sequencing, micro-injectie en confocale beeldvorming.
- Noodzaak van strikte standaardisatie tussen teams voor fenotypische scoring en data-analyse.
- Aanpassing aan andere ontwikkelingsstadia of hersenregio's kan protocoloptimalisatie vereisen.
- Lange trainingsperioden en technische vaardigheid zijn essentieel voor reproduceerbare in vivo resultaten.
