Isolatie en Cellulaire fenotypering van mesenchymale stamcellen afkomstig van de gewrichtsvloeistof en beenmerg van minivarkens

Het algemene doel van deze procedure is de niet-invasieve verzameling van synoviale vloeistof en beenmerg uit minivarkens om mesenchymatische stamcellen te verzamelen die kunnen worden gebruikt in regeneratie- en immunomoduleringsstudies. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van MSC-therapie voor oorartsen, zoals hoe de synoviale vloeistof in MSC kan worden vastgesteld en hoe ze kunnen worden gekarakteriseerd in vergelijking met beenmerg-MSC. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het effectief vaststellen van de belangrijkste eigenschappen van synoviale vloeistof en beenmerg-afgeleide MSC's van minivarkens, wat nuttig zal zijn voor toepassing bij patiënten.

De implicaties van deze techniek strek zich uit tot de therapie van verschillende gewrichtsaandoeningen, omdat de populatie van de synoviale vloeistof-afgeleide MSC in de synoviale holte significant toeneemt bij atletische patiënten. Hoewel deze methode inzicht kan geven in regeneratieve geneeskunde, kan deze ook worden toegepast op andere onderzoeken, zoals onderzoek naar auto-immuunziekten. Omdat minivarkens-MSC's autoloog zijn, kan immunosuppressie mensen interesseren.

Naast de andere wetenschappers zullen Hyeon-Jeong Lee en Won-Jae Lee van mijn niveau drie de procedure demonstreren. Om te beginnen, oriënteer een geanesthetiseerd minivarken om de iliacale kam te bereiken. Vervolgens, depileren van een 15-vierkante centimeter gebied op de iliacale kam, met behulp van een scheermes of tondeuse.

Vervolgens, schrob de blootgestelde huid drie keer afwisselend met povidon-jodium en 70%ethanol. Eens volledig gedroogd, breng steriele drapen aan. Nu, voorcoat een tien-milliliter spuit met heparine, met behulp van een spoeling van drie- tot vier-milliliter.

Dit zal voorkomen dat het beenmerg stol als het wordt geëxtraheerd. Vervolgens, precies op de iliacale botkam, bevestig een beenmerg extractor stevig aan de heparine-gecoate spuit, en extraheer minimaal vijf milliliter beenmerg. Om de cellen van het geëxtraheerde beenmerg te isoleren, verdun deze eerst met een gelijk volume DPBS in een 15-milliliter conische buis bij kamertemperatuur.

Vervolgens, laad drie milliliter dichtheidscentrifugeringsmedium in een tweede 15-milliliter conische buis. Vervolgens, breng voorzichtig vier milliliter van het verdunde beenmerg op het dichtheidscentrifugeringsmedium om twee-oplossingslagen te creëren. Nu, centrifugeer de buis bij 400 Gs gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur.

De gewenste MNC's worden verzameld in de centrale witte laag. Aspireer alleen deze laag. Spuit de MNC-laag uit in een 15-milliliter conische buis, en verdun met zeven tot acht milliliter DPBS.

Vervolgens, centrifugeer de cellen bij 500 Gs gedurende tien minuten bij kamertemperatuur. Gooi de supernatant weg, en was de palleted cellen twee keer met tien milliliter DPBS, herhaal de vorige centrifugatiecyclus. Na de twee wasbeurten, we suspenderen de MNC's in twee milliliter ADMEM.

Vervolgens, laad de cellen op een 35-millimeter weefselcultuurbakje, en incubeer ze bij 38,5 graden Celsius in een bevochtigde 5% koolstofdioxide incubator. Na 48 uur, aspireer het medium samen met de niet-bevestigde MNC's. Vervolgens, voeg twee milliliter vers ADMEM toe, en vervolg de incubatie, het medium elke drie dagen vervangen.

Wanneer de cellen 70 tot 80% confluency bereiken, was de cultuur met vers DPBS. Vervolgens, dissocieer de cellen, met behulp van een milliliter van 0,25% Trypsin-EDTA gedurende drie tot vijf minuten bij 37 graden Celsius. Verzamel de cellen in tien milliliter ADMEM, en breng ze over in een 15-milliliter conische buis.

Vervolgens, centrifugeer de cellen bij 300 Gs gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, en gooi de supernatant weg. Nu, suspendeer de geoogste MNC's in één milliliter vers ADMEM, en meet hun dichtheid. Beëindig met het plateren van tussen 1/2 en drie-kwart miljoen cellen in T25 flessen met vier milliliter ADMEM.

Incubeer de flessen net zoals de platen, en verander het medium elke derde dag. Bereid een 15x10 centimeter sectie huid boven de dijgewricht voor, zoals gedaan bij de voorbereiding voor beenmergverzamelingen. Vervolgens, palpeer voor de patella en tibia kammen onder de huid om het synoviale gewricht te identificeren, en steek een drie-milliliter spuit met een 23-gauge naald, precies in het gewricht.

Gebruik zachte zuiging om tussen 1/2 en één milliliter vloeistof te extraheren, en trek onmiddellijk de naald terug. Als het volume van de synoviale vloeistof te klein is, spoel dan de holte met DPBS om synoviale vloeistof met DPBS te verzamelen. Het volume DPBS om te gebruiken varieert met de grootte van de synoviale holte.

Het optimale volume van synoviale vloeistof is beperkt in gezond gewricht. Het volume varieert met de grootte en pathologische toestand van het gewricht. Om de cellen van de synoviale vloeistof te isoleren, verdun de vloeistof met een gelijk volume DPBS in een 15-milliliter conische buis bij kamertemperatuur.

Vervolgens, verplaatsen we het puin door de verdunning door een 40-micron nylon cel zeef te filteren. Vervolgens, voeg tien meer milliliter DPBS toe, en centrifugeer de suspensie bij 400 Gs gedurende tien minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens, gooi de supernatant weg, en was de cellen twee keer, met behulp van DPBS.

We suspenderen de gewassen cel pallet in twee milliliter ADMEM. Vervolgens, gaan we verder met het kweken van de cellen zoals gedemonstreerd met de MSC's. MSC's werden met succes geïsoleerd uit het beenmerg en gewrichtssynoviale gewrichten van de minivarkens en uitgebreid in vitro.

De morfologie van synoviale vloeistof-afgeleide MSC's is vergelijkbaar met die van beenmerg-afgeleide MSC's: beide hebben een fibroblastische spindelvorm en zijn homogeen adherant. De MSC's toonden een positieve expressie voor alkalische fosfatase-kleuring nadat de derde subcultuur was voltooid. Vervolgens, werden oppervlaktemarkers geanalyseerd in beide culturen.