Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden

Het algemene doel van deze procedure is om menselijke pulpa-stamcellen uit permanente tanden te isoleren, te karakteriseren en te differentiëren met behulp van twee methoden. Dit wordt bereikt door gezonde, geïmpacte verstandskiezen te verzamelen en deze in eerste instantie door te snijden ter hoogte van de grens tussen cementum en glazuur. Dentale pulpa-stamcellen (DPSCs) worden geïsoleerd via twee verschillende methoden.

In de eerste methode worden polypweefsels enzymatisch verteerd door incubatie in collagenase type one plus disc space solution. Deze noemen we hier ed. Wat betreft de isolatiemethode in de tweede methode, worden polypweefsels enkel in de kolf geplaatst zonder enige digestie.

Op deze manier beginnen dpss vanuit het weefsel naar de kolf te migreren. Deze cellen, aangeduid als OG, verwijzen naar de outgrowth-isolatiemethode. De tweede stap van de procedure is de identificatie van stamcellen met behulp van flowcytometrie.

De derde stap van de procedure is de inductie van odontoblastdifferentiatie, en de laatste stap van de procedure is de vergelijkende evaluatie van de odontoblastdifferentiatie tussen twee groepen middels Alizarine R-kleuring en qPCR. Ik ben RA Kde van de Afdeling Stamcellen en Ontwikkelingsbiologie aan het Rian Institute. Vandaag ga ik u de isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen laten zien met behulp van twee methoden.

Hallo, ik ben Dr. Rezaian van het Rio Institute. We werken aan een project met betrekking tot menselijke dentale pulpstamcellen. Deze cellen zijn een soort mesenchymale stamcellen, die gemakkelijk te verkrijgen zijn met minimale pijn en morbiditeit.

Mesenchymale stamcellen worden gekenmerkt door hun vermogen tot plastische expansie, kolonievorming en een multifunctioneel differentiatievermogen. Hallo, ik ben dr. Ami van de afdeling Stamcellen. Binnen ons instituut gebruiken we deze procedure in ons laboratorium om stamcellen te isoleren voor onderzoeksdoeleinden en toekomstige toepassingen.

In de regeneratieve geneeskunde is de allereerste stap bij het gebruik van deze bron van stamcellen voor toekomstige stamceltherapie het kiezen van het beste protocol voor het isoleren van stamcellen uit menselijk weefsel. Om dit doel te bereiken, is het cruciaal om bepaalde aspecten van het cellulaire gedrag onder verschillende isolatiecondities voor stamcellen te onderzoeken. Eerst ga ik menselijke dentale pulpa-stamcellen isoleren door middel van ofwel enzymatische dissociatie van de pulpa of door uitgroei van stamcellen uit weefselimplantaten.

Karakteriseer ze vervolgens en differentieer ze tot ogen blast. Laten we beginnen. Eerst wegen we de space en collagenase Type one af en lossen we beide op in PBS.

Filter deze vervolgens met een spuitfilter van 0,2 micron. Trek beide op in een conische buis. Voeg daarna Phenol en PBS toe om de uiteindelijke concentratie te bereiken.

Breng gezonde verstandskiezen in een koud basismedium onder steriele omstandigheden naar het laboratorium. Reinig het oppervlak van de tand met 70% ethanol voorafgaand aan het onderzoek. Zorg ervoor dat alle debris van het tandoppervlak wordt verwijderd.

Snijd de tand rond de junctie van cementum en glazuur door middel van een gestereerde dentale schijf om de pulpakamer bloot te leggen. Er moet rekening mee worden gehouden dat het snijproces langzaam moet worden uitgevoerd om oververhitting van het tandweefsel te voorkomen. Scheid vervolgens voorzichtig het pulpaweefsel van de kroon door het pulpaweefsel met een Scarpa-mesje in stukjes van één tot twee millimeter te snijden.

Breng kleine stukjes pulpageweefsel over naar één milliliter enzymoplossing voor één uur bij 37 °C en vortex elke 30 minuten om het afbreken van het pulpageweefsel te bevorderen. Verwijder vervolgens grote aggregaten door ze door een cellzeef van 70 micron te leiden. Voeg daarna PBS toe dat PENER bevat en centrifugeer bij 1.200 RPM gedurende vijf minuten.

Verwijder het supernatant voorzichtig. Suspendeer vervolgens de plaat in het proliferatiemedium en breng dit over naar de kweekfles en voeg medium toe. Incubeer vervolgens.

Vervang het medium elke drie dagen tot de celconfluentie is bereikt voor de outwork-methode. Herhaal het snijproces. Met het snijden van de tand wordt bedoeld dat het weefsel in fragmenten van één tot twee millimeter wordt verdeeld.

Plaats ze vervolgens in de kweek. Voeg proliferatiemedium toe en incubeer ze. Er moet rekening mee worden gehouden dat het totale volume van het proliferatiemedium voldoende moet zijn om de aanhechting van alle fragmenten te ondersteunen voor verdere celuitgroei.

Vervang het medium nadat uitgroei is waargenomen en daarna elke drie dagen totdat de celconfluentie is bereikt. Voor immunofenotypering worden beide typen D PSC's gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius in het donker geïncubeerd met PE- of FITC-geconjugeerde antilichamen. Voeg vervolgens PBS toe en centrifugeer bij 1.200 RPM gedurende vijf minuten.

Verwijder het supernatant en resuspendeer de plaat in PBS en evalueer vervolgens de oppervlaktemarkers met behulp van een flowcytometer; subcultiveer beide typen DPC's gedurende drie passages. Behandel deze vervolgens met trypsine op ijs en breng ze over naar zes rode kweekschalen bij een confluentie van 60% en vervang PM door odontogeen medium. Drie wells blijven dienen als negatieve controle door toevoeging van pm.

Vervang het medium elke drie dagen; was de cellen op dag 21 met PBS. Fixeer ze vervolgens met één milliliter per well van 10% formalgel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder na 15 minuten voorzichtig het fixeermiddel en spoel de cellen drie keer met gedestilleerd water. Vervang het water vervolgens door één milliliter kleurstofoplossing per red alza. Verwijder na 20 minuten de overtollige kleurstof en was de cellen vier keer met gedeïoniseerd water.

Voeg vervolgens één milliliter water per put toe om te voorkomen dat de cellen uitdrogen. Na de kleuring kunt u onder de microscoop zien dat drie bovenrails rood kleuren in vergelijking met de controles; bij een grote vergroting is de absorptie van de kleurstof rond de cel zichtbaar voor de kwantificering van de rode kleuring. Verwijder het water en voeg vervolgens één milliliter 10% azijnzuur per put toe, waarna het geheel gedurende 30 minuten onder schudden wordt geïncubeerd.

Schraap vervolgens voorzichtig de cellen van de plaat met een celscraper. Draag ze daarna over naar afzonderlijke buisjes. Vortexeer krachtig gedurende 30 seconden.

Verwarm ze vervolgens 10 minuten lang tot 85 °C. Om verdamping te voorkomen, worden de buisjes afgesloten met ParaView. Verplaats de buisjes vijf minuten naar ijs en centrifugeer ze vervolgens 15 minuten lang bij 20.000 G. Maak ondertussen een seriële verdunning van de Alizarin Rood-standaard volgens het protocol van de regio.

Verwijder na de centrifugatie de supernatant en breng deze over naar nieuwe buisjes. Neutraliseer de pH met 10% ammoniumhydroxide. Voeg vervolgens de standaarden en monsters toe aan de 96-wellsplaat.

Plaats de monsters in een wellplaat, meet vervolgens de absorbentie bij 405 nanometer en analyseer de gegevens volgens de standaard seriële verdunning. Hier ziet u DPSCs, die zijn geïsoleerd door enzymatische dissociatie op dag 10, 15 en 18, en ook uitgegroeide DPSCs op dag 5, 10, 13 en 18. Beide typen DPSCs in fase drie hebben bijna dezelfde grootte en morfologie. De resultaten van de immunofenotypering tonen de aanwezigheid van mesenchymale stamcelmarkers zoals CD 44, CD 73 en CD 19, en de afwezigheid van hematopoëtische en endotheelmarkers zoals CD 34, CD 45 en CD 11 B. Interessant is dat de expressies van CD 105 en CD 146 hoger zijn in uitgegroeide DPSCs in vergelijking met D-P-S-C-E-D; de kwantificering van Alizarin Red-kleuring op dag 21 van de odontoblastdifferentiatie laat meer calciumafzetting zien in D-P-S-C-E-D in vergelijking met odontoblast-stamcellen zonder con dental top.

De qPCR-resultaten wijzen ook op significant hogere expressieniveaus van MEP en ALP als mineralisatiemarkers in D-P-S-C-D vergeleken met de oorspronkelijke dentale stamcellen. Ondertussen worden beide genen gereguleerd tijdens de differentiatie, en neemt ook de expressie van DSPP als odontogene marker toe tijdens de differentiatie. Er is echter geen significante variatie in de expressie van DSVP in gedifferentieerde cellen tussen de ED- en OG-groepen.

We hebben zojuist laten zien hoe menselijke dentale stamcellen kunnen worden geïsoleerd door middel van enzymatische dissociatie van pulpa of door uitgroei van stamcellen uit een weefselexplantaat. Dat is alles. Ik wens u veel succes bij het toepassen van deze procedure in uw experiment.

Dank u wel.