Detectie van de pH-afhankelijke activiteit van

Het algemene doel van deze in vivo en in vitro chaperone-assays is het karakteriseren van de pH-afhankelijke activiteit van de Escherichia coli chaperone HdeB onder zure pH-condities. Zuurgeactiveerde chaperones hebben slechts één taak: ze moeten eiwitten beschermen tegen zuur-geïnduceerde eiwitontvouwing en degradatie. Deze functie is bijzonder belangrijk voor enterische bacteriën, die de zure omgeving van de maag moeten overleven om de darmen succesvol te kunnen koloniseren.

De methoden die we hier presenteren, stellen u in staat om zuurgeactiveerde chaperonnes te identificeren en te karakteriseren, en om de pH-condities te bepalen die leiden tot hun activatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het karakteriseren van chaperonnes, zoals HdeB in vitro en in vivo, wat u helpt bij het ontcijferen van het mechanisme van de activatie ervan. Deze methoden zijn succesvol toegepast op andere zuurbeschermende chaperonnes, zoals HDA, en kunnen verder worden aangepast voor gebruik met andere chaperonnes en/of stresscondities.

De invloed van gezuiverd HdeB op de aggregatie van thermisch ontvouwde porcine mitochondriale malaatdehydrogenase bij verschillende pH-waarden wordt gemonitord. Dialyseer MDH gedurende één nacht bij vier graden Celsius tegen vier liter buffer C. Concentreer vervolgens het eiwit tot ongeveer 100 µM met behulp van centrifugale filtereenheden met een moleculaire gewichtsafsnijding (molecular weight cutoff) van 30 kDa. Centrifugeer het eiwit 20 minuten lang bij 20.000 ×g bij vier graden Celsius om aggregaten te verwijderen.

Bepaal de MDH-concentratie door middel van absorptie bij 280 nanometer. Bereid vervolgens aliquots van 50 micro liter MDH en vries deze aliquots snel in voor bewaring. Plaats een kwartscuvet van één milliliter in een fluorescentie-spectrofotometer die is uitgerust met temperatuurgecontroleerde monsterhouders en roerders.

Stel de excitatie- en emissiegolflengte in op 350 nanometers. Voeg de juiste volumes voorverwarmde buffer D bij de gewenste pH-waarden toe aan de cuvet. Het totale volume is 1 000 microliters.

Stel de temperatuur in de cuvethouder in op 43 °C. Voeg 12,5 µM HdeB toe aan de buffer, gevolgd door de toevoeging van 0,5 µM MDH. Start met het monitoren van de lichtverstrooiing.

Incubeer de reactie gedurende 360 seconden om een voldoende ontvouwing van MDH mogelijk te maken. Verhoog de pH naar zeven door een volume van 0,16 tot 0,34 aan twee molar ongebufferde dipotassiumfosfaat toe te voegen, en ga door met het registreren van de lichtverstrooiing voor nog eens 440 seconden. Analyseer de gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol.

Transformeer het plasmide dat HdeB tot expressie brengt of de MD-vectorkontrole, PBAD 18, in stam BB7224 Delta RPOH met behulp van chemisch competente cellen. Deze stam is temperatuurgevoelig en moet worden gekweekt bij 30 °C. Na 45 seconden hitteshock bij 42 °C en vóór het uitplaten, moeten de cellen worden geïncubeerd bij 30 °C en 200 RPM.

Voer uitstrijkjes van enkelvoudige kolonies uit voor de positieve klonen en incubeer deze gedurende de nacht bij 30 degrees Celsius. Bereid een overnight-cultuur voor in 50 milliliters LB met ampicilline en kweek de cellen bij 200 RPM en 30 degrees Celsius. Verdun de overnight-culturen 40-voudig in 25 milliliters LB met ampicilline.

Kweek de bacteriën in aanwezigheid van 0,5% arabinose bij 30 °C en 200 RPM tot een optische dichtheid bij 600 nanometer, of OD 600 gelijk aan 1,0, om de expressie van het HDEB-eiwit te induceren. Gebruik voor de pH-shift-experimenten LB met ampicilline en arabinose om de cellen te verdunnen tot een OD 600 van 0,5. Stel de respectievelijke pH-waarden in door het toevoegen van geschikte volumes van vijf molar zoutzuur.

Na de aangegeven tijdstippen worden de culturen geneutraliseerd door toevoeging van de passende volumes vijf molaire natriumhydroxide. De groei van de geneutraliseerde culturen en de vloebcultuur wordt gedurende 12 uur bij 30 °C gemonitord met behulp van OD-metingen. Om het pH-optimum van de chaperone-activiteit van HdeB in vitro te onderzoeken, werd natieve MDH verdund in voorverwarmde buffer met de aangegeven pH, in aanwezigheid of afwezigheid van HdeB.

Na een incubatie van 360 seconden werd de aggregatie van MDH bij 43 graden Celsius geïnduceerd door neutralisatie. In aanwezigheid van HdeB is het lichtverstrooiingssignaal aanzienlijk verminderd na neutralisatie vanaf pH vier, wat aangeeft dat HdeB de aggregatie van MDH voorkomt. Aggregatiemetingen zijn zeer gevoelig voor veranderingen in temperatuur of buffersamenstelling.

Om fout-positieve resultaten te elimineren, werd de invloed van de chaperone-bewaarbuffer op de aggregatie van de client onderzocht. De HdeB-bewaarbuffer had geen effect op de MDH-aggregatie. Om de effecten van HdeB in vivo te onderzoeken, werden pH-afhankelijke overlevingstesten uitgevoerd met gebruik van de temperatuurgevoelige RPOH-deletiestam.

Deze stam mist de meeste chaperonnes en is daarom gevoeliger voor verhoogde temperaturen, een lage pH of oxidatieve stress. Overexpressie van HdeB onder neutrale pH-omstandigheden vertoonde geen effect op de groeisnelheid van de stam, die vergelijkbaar goed groeide als de controlestam die de lege vector, PBAD 18, bevat. In tegenstelling hiermee werden duidelijke verschillen gevonden in hun vermogen om de groei te hervatten na behandelingen bij pH drie of pH vier, waarbij de HdeB-overexpresserende stam een reproduceerbaar verbeterd herstel vertoonde na behandeling met een lage pH in vergelijking met de controlestam.

Zodra de methode onder de knie is, kan de zuivering in drie dagen worden voltooid, de in vitro scatteringsassay in één dag en de in vivo overlevingsassays in twee dagen, mits deze correct worden uitgevoerd. Let bij het uitvoeren van deze experimenten erop dat u het experimentele ontwerp zorgvuldig overweegt, zowel wat betreft het type cliëntproteïnen als hun concentraties en de gebruikte buffercondities. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het helpt om een gedetailleerder inzicht te krijgen in het mechanisme van chaperone-activatie en de effecten daarvan in een in vivo context.

En vergeet niet dat het bestuderen van het pH-optimum van een zuurbeschermende chaperone vrij uitdagend kan zijn. Dit komt omdat het aggregatiegedrag van het gebruikte cliëntprotein waarschijnlijk ook verandert met de pH. Zorg er daarom voor dat u buffersystemen kiest die geschikt zijn voor zowel de chaperone als het cliëntprotein.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals spin-down assays via SCS-page, worden uitgevoerd voor de automatische kwantificering van chaperonne-gemedieerde onderdrukking van clientaggregatie.