Adenofection: Een methode voor het bestuderen van de rol van de Molecular Begeleiders in Cellular Morfodynamica door uitputting-Rescue Experimenten

Het algemene doel van deze methode is om depletion rescue-experimenten mogelijk te maken onder omstandigheden die de cellulaire integriteit en proteïnehomeostase behouden voor functionele analyses van biologische processen op enkelcelniveau.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over eiwitfuncties en structurele vereisten in celdynamica, zoals mitose en celdifferentiatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een eiwit van belang kan worden afgebroken, terwijl gelijktijdig een variant van dit eiwit op een bijna fysiologisch niveau kan worden geïntroduceerd in een groot deel van een celpopulatie.

Begin met het coaten van glazen bodemschaaltjes met fibronectine. Hiervoor dient een fibronectine-voorraadoplossing van 1 mg/mL 1:100 te worden verdund met steriele PBS.

Voeg één milliliter toe aan elke schaal van 35 milliliter om het gehele oppervlak te bedekken. Incubeer gedurende één uur bij 37 °C en 5% CO2. Warm tijdens de incubatie alpha MEM aangevuld met 10% FBS en een aliquot van 0,05% trypsine EDTA voor tot 37 °C.

Na 45 minuten incubatie begint u met het bereiden van de celoplossing. Aspireer het medium uit een plaat van 10 centimeter met HeLa-RFP-H2B-cellen. Spoel vervolgens voorzichtig twee keer met 1,5 milliliters 0,05% trypsine EDTA.

Laat na de laatste aspiratie 0,5 milliliters trypsin EDTA op de plaat achter en incubeer de cellen gedurende twee tot drie minuten bij 37 °C en 5% carbon dioxide.

Tik voorzichtig op de plaat en observeer de cellaag onder de microscoop om te verifiëren dat alle cellen zijn losgekomen. Voeg vervolgens 10 milliliters medium toe en pipetteer voorzichtig enkele keren om de cellen te scheiden en breng de celsuspensie over in een 15 milliliter buis.

Tel een monster van 10 µL van de celstuspensie met behulp van een hemocytometer. Aspireer vervolgens de fibronectine-oplossing uit de schaaltjes met glazen bodem. Zorg dat de fibronectine niet opdroogt vóór het uitplaten van de cellen.

Bereid een celsuspensie voor om 1,5 × 10⁵ cellen per 35 millimeter schaal uit te platen in twee milliliter medium. Plate één extra 35 millimeter schaal bovenop het aantal condities om het celgetal te tellen voorafgaand aan de virustransductie. Incubeer gedurende 30 tot 45 minuten. Controleer na afloop van de incubatietijd de cellen onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de cellen goed gescheiden zijn, zoals hier te zien is. Plaats de schalen terug in de incubator en kweek de cellen tot de volgende dag.

Controleer de dag na het uitplaten of de cellen een dichtheid van ten minste 50% hebben bereikt. Een celdichtheid lager dan 50% leidt tot een verminderde efficiëntie van de virustransductie, een grotere variatie in eiwitexpressie per cel en een verhoogde celtoxiciteit. Oogst vervolgens de cellen uit de aanvullend uitgeplaatte schaal zoals voorheen en tel het aantal cellen. Bereken het volume virussen dat nodig is voor een efficiënte transductie van de cellen. Label voor elke conditie een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en voeg 400 microliters warme alpha MEM minus toe. Voeg na het langzaam ontdooien van de virusaliquots op ijs het benodigde volume van elk virus toe aan de buizen en meng dit voorzichtig door te pipetteren. Aspireer vervolgens het medium van de cellen en voeg het virusmengsel voorzichtig druppelsgewijs toe. Incubeer de cellen bij 37 degrees Celsius met 5%carbon dioxide. Schud de platen gedurende een uur elke 15 minuten voorzichtig in de steriele laminaire flowkast om de cellen met het virus te bedekken. Het gebruik van een kleine hoeveelheid medium vergemakkelijkt het contact tussen het virus en de cellen.

Pipetteer na de incubatie voorzichtig 1,6 milliliters alpha MEM minus in elke plaat om een totaalvolume van twee milliliters te verkrijgen. Start vervolgens de cellsynchronisatie door twee millimolar thymidine toe te voegen voordat de cellen nog eens twee uur worden geïncubeerd.

Bereid ondertussen het siRNA-transfectiemengsel voor door in een microbuisje 139 µL steriel water, 50 µL 1 M calciumchloride en 11 µL 20 µM siRNA toe te voegen. Indien geen siRNA nodig is, vervang dan de hoeveelheid siRNA door steriel water om een lege transfectie uit te voeren. Voeg druppelsgewijs langzaam HBSS-2X-oplossing toe aan het calciumchloride-siRNA-mengsel. Meng het geheel voorzichtig twee keer door luchtinjectie met een 200 µL pipette, aangezien kleinere precipitaten leiden tot een betere transfectie-efficiëntie. Incubeer het mengsel vervolgens 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na de incubatie langzaam 200 µL druppelsgewijs toe aan elke plaat en schud om te mengen. Incubeer de platen 16 uur bij 37 °C en 5% CO2.

Verwijder de volgende dag de schalen uit de incubator en transporteer deze naar een weefselkweekkast. Spoel de cellen twee keer af met twee milliliters warme HEPES en voeg vervolgens twee milliliters alpha MEM minus toe voordat u ze terugplaatst in de incubator.

Voeg zeven uur later twee millimol thymidine toe aan de platen voordat u deze terugplaatst in de incubator. Werk met maximaal vier celplaten tegelijk, aangezien temperatuurvariaties de lengte van de celcyclus beïnvloeden. De volgende dag, 48 uur na de siRNA-transfectie en virusinfectie, spoelt u de cellen twee keer met twee milliliter warme PBS en voegt u vervolgens twee milliliter alpha MEM zonder fenolrood toe voor live-cell imaging. Incubeer gedurende zeven uur.

Voer kortstondige live cell imaging-experimenten uit op mitotische cellen met een omgekeerde microscoop die is uitgerust met een bevochtigde, thermo-gereguleerde kamer met 5% carbon dioxide. Controleer vóór de acquisitie of de kamer de juiste temperatuur van 37 °C heeft bereikt.

Plaats de kweekschaaltjes één uur voor de acquisitie in de microscoopkamer om een juiste equilibratie van het medium mogelijk te maken en focusdrift door temperatuurveranderingen te voorkomen. Controleer de mitotische status van de cellen. Op dit punt zouden 10 tot 15% van de cellen zich in de vroege stadia van de mitose moeten bevinden.

Stel tijdens de equilibratietijd de acquisitieparameters in zoals bepaald in eerdere experimenten. Het is belangrijk om een passende resolutie te bereiken zonder fotobleking, aangezien dit celbeschadiging veroorzaakt en de mitotische progressie verstoort. Kies per conditie meerdere velden met cellen die zich bij de mitotische entry bevinden, om een significant aantal cellen te verkrijgen voor analyse zonder het acquisie-interval te overschrijden. Zodra alle velden zijn gekozen, dient de focus opnieuw te worden ingesteld en de acquisitie zo snel mogelijk te worden gestart.

Bij gebruik van een spinning disc confocale systeem zou een typische opstelling vier verschillende condities bevatten, zeven gezichtsvelden per plaat en twee kleurkanalen met een interval van 1,5 tot twee minuten over een periode van 75 minuten. Bepaal goed gedefinieerde criteria voor de analyse van mitotische fenotypen in cellen, wat afhankelijk zal zijn van de gebruikte fluorescente markers.

In tegenstelling tot de transfectie van BAG3-GFP-plasmide-DNA, zoals links te zien is, maakt adenofectie met recombinante adenovirussen, hier rechts getoond, een meer homogene en efficiënte expressie van BAG3-GFP mogelijk in het grootste deel van de celpopulatie bij een lage multiplicity of infection. Deze representatieve western blot laat zien dat adenofectie met BAG3-specifieke siRNAs en recombinant adenovirus BAG3-GFP een efficiënte depletie van endogeen BAG3 en reïntroductie van het BAG3-GFP-eiwit op bijna endogene niveaus mogelijk maakt. Zoals hier getoond, kan adenofectie de eiwithomeostase behouden, aangezien er geen detecteerbare toename is in de niveaus van stress-geïnduceerde heat shock proteins in adenofecteerde HeLa-cellen, in tegenstelling tot HeLa-cellen behandeld met de proteotoxische stress-inducer MG132. Hier zien we dat de progressie van cellen door de mitose niet significant wordt verstoord door adenofectie, zoals blijkt uit deze confocale time-lapse beelden van HeLa-cellen die zijn adenofecteerd met controle siRNA en BacMam-GFP alpha Tubulin, en BacMam-RFP Actin.

De grafiek geeft het aandeel cellen met abnormale mitose aan. Cellen die uitsluitend waren getransfecteerd met BAG3-specifiek siRNA vertoonden een ongeveer tweevoudige toename van het niveau van mitotische defecten, zoals weergegeven door de rode balk; dit werd hersteld tot bijna het niveau van de controlecellen door re-introductie van BAG3-GFP, weergegeven door de zwarte balk.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u depletion rescue-experimenten uitvoert met behulp van adenofectie. Deze methode biedt een snel en eenvoudig systeem om hypomorfe knock-downs te creëren voor structuur-functieanalyse in meerdere cellulaire achtergronden. Door deze methode te volgen kunnen de belangrijkste structurele vereisten van het eiwit van belang voor een bepaalde functie worden geïdentificeerd. Andere benaderingen van genoomredigering kunnen vervolgens worden gebruikt om de betrokken mechanismen verder te verdiepen.