Uitbreiding van nanopatterned Substrates met steek Techniek voor Nanotopographical Modulation of Cell Behavior
8 december 2016
Een protocol voor het produceren van een groot gebied van nanogepatterreerde substraten uit kleine nanogepatterreerde mallen voor studie van nanotopografische modulatie van celgedrag wordt gepresenteerd.
Het algemene doel van deze procedure is om een groot gebied van nanogepatternd substraat te produceren van kleine nanogepatternde mallen door een eenvoudige en betaalbare, maar veelzijdige hechttechniek te gebruiken. Deze methode kan helpen bij het bestuderen van de modulatie van substraatnanotopografie op celfenotype en functie op cellulair en moleculair niveau, zoals expressie van focale adhesie-eiwitten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig en kosteneffectief is.
Begin met het voorbereiden van de gesilaaniseerde siliciummal in het PDMS-prepolymeer, zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de gesilaaniseerde siliciummal in een 60 millimeter Petrischaal. Giet het PDMS-prepolymeer op de siliciummal in de Petrischaal.
Plaats de Petrischaal in een plastic exsiccator en ontgas gedurende ongeveer 10 minuten, totdat alle bubbels verdwijnen. Breng de Petrischaal over naar een hotplate en laat het PDMS-prepolymeer gedurende vier uur drogen op 70 graden Celsius. Verwijder voorzichtig de PDMS-mal van de siliciummal met behulp van pincetten.
Bepaal de oriëntatie van anisotrope PDMS-nanopatronen, zoals nanogratingen, onder een optische microscoop en markeer deze op de achterkant van de PDMS-mallen met een markeerstift. Reinig het siliciumsubstraat met ethanol in een afzuigpunt en droog het vervolgens met perslucht. Snijd de ongepatternde gebieden van elke PDMS-mal af met een mes.
De PDMS-mallen moeten zo dicht mogelijk worden uitgelijnd, maar niet raken aan de omringende mal, om het ongepatternde gebied te minimaliseren en om te voorkomen dat het nanopatroondeformatie raakt wanneer de compressorkracht wordt toegepast. Plaats de afgesneden PDMS-mal met het nanopatroon naar beneden op de spiegelzijde van het siliciumsubstraat en lijn vervolgens andere mallen dicht bij, maar zonder aanraking met de omringende mallen. Het is van cruciaal belang om te proberen de PDMS op de basale laag te drogen, omdat ongedroogd PDMS door de opening tussen de meerdere mallen kan stromen en de nanopatronen kan beschadigen.
De volledig uitgeharde PDMS kan de meerdere mallen echter niet aan elkaar hechten. Om een PDMS-kleurlaag voor te bereiden, giet u één gram ontgast PDMS-prepolymeer op een schone glazen plaat om een laag van 0,5 millimeter dik te vormen. Bak de PDMS-laag gedurende drie tot vijf minuten op 100 graden Celsius op een hotplate.
Gebruik een naald om de laag aan te raken en zorg ervoor dat de laag gedeeltelijk, maar niet volledig is uitgehard. Plaats de PDMS-laag op de achterkant van de uitgelijnde PDMS-mallen, draai deze assemblage snel om en breng deze over naar de hotplate. Breng een druk op de assemblage aan met behulp van een metalen blok bovenop de assemblage om een goede contact tussen de PDMS-kleurlaag en de achterkant van de PDMS-mallen te garanderen.
Droog de PDMS-kleurlaag gedurende een uur op 100 graden Celsius. Schakel de hotplate uit, verwijder het metalen blok en verwijder de enkel-gehechte PDMS-mal van het siliciumsubstraat. Om de gehechte PDMS-mal in de PS-plaat te nano-imprinten, plaatst u de PS-plaat in een aluminium spacer op een drie inch siliciumwafer.
Verwarm de PS-plaat op een hotplate gedurende 30 minuten op 250 graden Celsius. Plaats vervolgens de gehechte PDMS-mal, met nanopatronen naar beneden, op de gesmolten PS-plaat. Plaats vervolgens een aluminium plaat op de glazen plaat van de gehechte PDMS-mal.
Breng een drukkracht aan door metalen blokken op de aluminium plaat te gebruiken en wacht drie minuten. Til en vervang het metalen blok van de aluminium plaat en verhoog de drukkracht tot 25 kilopascal. Herhaal vervolgens deze stap met de druk verhoogd tot 50 kilopascal.
Houd de temperatuur van de hotplate tussen 240 en 250 graden Celsius onder een consistente druk van 50 kilopascal gedurende 15 minuten. Schakel de hotplate uit en laat de hele setup afkoelen. Verwijder de metalen blokken nadat de temperatuur onder 50 graden Celsius is en verwijder voorzichtig de gehechte PDMS-mal van de PS-plaat.
Om de PDMS-mal op een PS-dunne film te nano-imprinten, plaatst u de gehechte PDMS-mal met nanotopografie naar beneden op de PS-dunne film, die op een hotplate is geplaatst. Breng een druk van 12 kilopascal op de PDMS-mal aan door metalen blokken op de glazen plaat van de PDMS-mal te gebruiken. Verhoog de temperatuur van de hotplate tot 180 graden Celsius en houd deze gedurende 15 minuten vast.
Schakel de hotplate uit en laat de hele setup afkoelen. Verwijder de metalen blokken nadat de temperatuur onder 50 graden Celsius is gedaald en verwijder voorzichtig de gehechte PDMS-mal van de PS-film. Snijd de nanogepatternde PDMS-substraten met behulp van een hol stalen boogsteun in schijven om ze te passen in de configuratie van een specifieke multi-well plaat.
Gebruik vervolgens pincetten om de PDMS-schijven in de putjes van de multi-well plaat te plaatsen. Steriliseer de PDMS-substraten door 30 minuten 70% ethanol te gebruiken. Aas vervolgens de ethanol op en volg dit op met UV-blootstelling gedurende 30 minuten.
Was de PDMS-substraten drie keer met 1X steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing. Bedek vervolgens de PDMS-substraten gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met extracellulair matrixeiwit. Spoel de PDMS-substraten drie keer met steriele PBS, elk gedurende vijf minuten.
Suspendeer menselijke A549 longkankercellen in Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium met 10% foetaal bovien serum en tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Plaat de cellen op een zaaidichtheid van 2.000 cellen per vierkante centimeter op de PDMS-substraten. Kweek de cellen gedurende één dag op 37 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer met 5% kooldioxide en observeer ze daarna.
De gegenereerde nanopatroon op de PS-plaat en de dunne film worden hier getoond. De pijlen geven de polymeerverhoging in de interstices van de gehechte PDMS-mallen aan. Deze SEM-beelden tonen aan dat PDMS-werksubstraten getrouw
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het produceren van een groot oppervlak van nanopatroon-substraten vanuit kleine nanopatroon-mallen. De methode richt zich op de studie van nanotopografische modulatie van celgedrag.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Celgedrag
- Nanotopografie
- Substraatengineering
Achtergrond
- Nanogestructureerde substraten beïnvloeden het celfenotype en de functie.
- Focale adhesie-eiwitten zijn essentieel voor het begrijpen van celinteracties met oppervlakken.
- Huidige methoden kunnen complex of kostbaar zijn.
- Er is een eenvoudige en betaalbare techniek nodig voor een bredere toepassing.
Doel van de studie
- Om een kosteneffectieve methode te ontwikkelen voor het creëren van grote nanopatroongebieden.
- Om studies te faciliteren naar hoe nanotopografie het cellulaire gedrag beïnvloedt.
- Om het begrip van cellulaire en moleculaire responsen op substraatwijzigingen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van gesilaniseerde siliciummallen.
- Gebruik van PDMS-prepolymeer voor de creatie van het substraat.
- Toepassing van een stitch-techniek voor patroonoverdracht.
- Gebruik van petrischalen voor de plaatsing van de mallen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle productie van grote nanopatroonsubstraten.
- Aangetoonde modulatie van celgedrag op basis van substraattopografie.
- Nadruk gelegd op de eenvoud en kosteneffectiviteit van de methode.
- Een basis geboden voor verdere studies naar cel-substraatinteracties.
Conclusies
- De gepresenteerde methode is een levensvatbare benadering voor het creëren van nanopatroon-substraten.
- Het opent nieuwe wegen voor onderzoek naar de modulatie van celgedrag.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek benutten om diverse cellulaire responsen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Het genereren van nanopatroonsubstraten met een groot oppervlak en een goed gedefinieerde structuur maakt robuuste fenotypische screening en mechanische risicoanalyse in de vroege ontdekkingsfase mogelijk. Deze aanpak ondersteunt targetvalidatie door reproduceerbare, schaalbare modellen te bieden om te beoordelen hoe nanotopografie de celverspreiding, adhesie en signalering beïnvloedt—cruciale fenotypes in oncologisch- en fibroseonderzoek. De betaalbaarheid en veelzijdigheid van de methode maken integratie in multi-well formats mogelijk, wat de cross-functionele samenwerking tussen bio-engineering, assay-ontwikkeling en translationele teams faciliteert.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om te onderzoeken hoe nanotopografie de expressie van focale adhesie-eiwitten en de celmorfologie moduleert, wat bijdraagt aan het testen van hypothesen over mechanotransductiepaden.
- Operationele waarde: Biedt gestandaardiseerde substraten met een groot oppervlak voor consistente celuitzaaiing en beeldvorming over replica's heen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert reproduceerbare nanotopografische signalen die kunnen worden gebruikt om verbindingen of genetische perturbaties te screenen die celadhesie en -spreiding beïnvloeden.
- Operationele waarde: Compatibel met multi-well plaatformaten, wat high-throughput preparatie van PDMS-schijfjes mogelijk maakt voor gestandaardiseerde assaycondities.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt ziekterelevante modellering met behulp van cellijnen zoals A549 om te bestuderen hoe substraattopografie het gedrag van kankercellen beïnvloedt, wat bijdraagt aan de betrouwbaarheid van preklinische targets.
- Operationele waarde: Maakt extrapolatie van discovery naar preklinische workflows mogelijk via herbruikbare, steriliseerbare PDMS-werksubstraten.
Integratie van Pipeline & Workflow
De stitch-techniek slaat een brug tussen nanofabricage en celgebaseerde assays, waardoor de generatie van nanopatronen een faciliterende mogelijkheid wordt in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek voor doelen die gericht zijn op mechanobiologie.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothese-gedreven testen van hoe topografische signalen het cel-fenotype beïnvloeden, wat bijdraagt aan de verduidelijking van signaalpaden in integrine- en FAK-signalering.
- Screening: Levert kwantificeerbare, door topografie gemoduleerde metrieken voor celspreiding op, die dienen als fenotypische readouts voor de modulatie van verbindingen of targets.
- Analytics: Maakt meting van celuitlijning, spreidingsoppervlak en morfologie mogelijk als output voor het vergelijken van experimentele condities.
- Translationeel Onderzoek: Gebruikt kankercelmodellen (bijv. A549) om nanotopografie te koppelen aan fenotypische responsen met potentiële relevantie voor modellering van de tumormicro-omgeving.
- Enterprise Reuse: De workflow voor PDMS-vormstitching en nano-imprinting is herbruikbaar over verschillende projecten, waardoor redundante nanofabricatie-inspanningen worden verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door de variabiliteit in nanotopografische inputs over experimenten heen te verminderen.
- Operationele waarde: Maakt kosteneffectieve, interne generatie van grootschalige nanopatronen mogelijk zonder afhankelijkheid van gespecialiseerde nanofab-faciliteiten.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen bij targetvalidatie door mechanistische inzichten te bieden in hoe fysische cues het celgedrag moduleren.
- Impact op portfolio: Vermindert het risico bij targets in vroege stadia door te verduidelijken of waargenomen fenotypes target-afhankelijk zijn of beïnvloed worden door substraatartefacten.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in zachte lithografie, de verwerking van PDMS en nanoimprinting-technieken.
- Is afhankelijk van toegang tot warmteplaten, vacuümdessicatoren, metalen blokken voor compressie en optische/SEM-beeldvorming voor de uitlijning en validatie van de mal.
- Maakt standaardisatie van het trimmen van de mal, de uitlijning en het uitharden van de adhesielaag noodzakelijk om vervorming van het nanopatroon te voorkomen.
- Aanpassing aan verschillende polystyreenformaten (dunne film versus plaat) vereist optimalisatie van de druk en temperatuur.
- Praktische beperkingen omvatten de uitlijningsprecisie aan de randen van de mal en potentiële interstitiële artefacten indien de compressiekracht ongelijkmatig is.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
Stitching of Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Molds into a Large, Single Mold
3:51
Generation of a Master Mold on Polystyrene (PS) Substrates
6:01
Nanotopographical Modulation of Cell Behavior
7:33
Results: Generated PS Nanopatterns and Nanotopography Modulation of Cell Morphology
8:26
Conclusion
