Het creëren van twee-dimensionale Patterned Substraten voor eiwit en Cell opsluiting

Het algemene doel van het volgende experiment is het ontwikkelen van een tweedimensionaal gepatrocineerd substraat voor de controle van eiwitadsorptie en celgroei. Dit wordt bereikt door middel van fotolithografie om een gepatrocineerde master te vervaardigen, die vervolgens wordt gebruikt om een A-P-D-M-S stempel te produceren voor microcontactprinten. Als tweede stap wordt het gepatrocineerde goudsubstraat voorbereid, waarbij microcontactprinten wordt toegepast om een patroon te creëren met regio's die eiwitten absorberen en regio's die eiwitten afstoten.

Vervolgens worden eiwitten en cellen aan het substraat toegevoegd om het patroon te visualiseren en te bestuderen. De resultaten van de cellulaire groei en het gedrag tonen, op basis van fluorescentie- en fasecontrastmicroscopie, een goede begrenzing van eiwitten en cellen op deze gepatroneerde substraten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande methoden, zoals MicroCon-printen van eiwitten, is dat de glycol-getermineerde monolaag aspecifieke absorptie van eiwitten en cellen in de achtergrond van het patroon voorkomt.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de juiste stempeltechniek moet worden geoptimaliseerd voor elk geprint patroon. Om te beginnen met de preparatie van het gepatteerde mastercentrum, spoel de siliciumwafer op de spin-coater met aceton tijdens de eerste stap van het twee-cycli-spinprogramma. Tijdens de tweede stap van het spinprogramma verdampt de aceton, waardoor er een schone, droge wafer overblijft; breng aan het begin van het spinnen photoresist aan op de wafer en voer vervolgens de spin-coating uit volgens de eerder beschreven condities.

Voer een soft bake uit van de met fotolak gecoate wafer bij 110 °C gedurende twee minuten met behulp van een hotplate met een hoge uniformiteit. Belicht vervolgens het fotopatroon op de met fotolak gecoate wafer met behulp van een mask aligner-systeem en een passend masker.

Plaats eerst het substraat op de vacuümtabel van de mask aligner. Plaats vervolgens het masker in de houderlade en schakel het vacuüm in om het masker op zijn plaats te houden, zodat een goed contact tussen het masker en het substraat wordt bevestigd. Verhoog het substraat totdat het het masker raakt.

Gebruik de optiek van de aligner om te bevestigen dat er een goed contact is gemaakt. Zet tenslotte de lamp aan om het substraat via het lithografiemasker bloot te stellen aan UV-licht. Ontwikkel de gepatroneerde wafer gedurende één minuut en 45 seconden in de ontwikkelaar onder milde agitatie.

Spoel grondig na met gedeïoniseerd water van halfgeleiderkwaliteit en droog met een stroom nitrogengas; controleer de patroonontwikkeling met een microscoop met een UV-filter. Begin deze procedure met het bereiden van een mengsel van hars en harder in een gewichtsverhouding van 10:1. Meng de cigar 180 2 volledig.

Bedek de wafer met het fotopatroon met het mengsel in een wegwerppetrischaal in een vacuümdesiccator. Ontgas de met PDMS bedekte master totdat er geen bellen meer zichtbaar zijn. Nadat is vastgesteld dat de master zich op de bodem van de schaal bevindt, laat u de stempel 1,5 uur uitharden in een oven bij 65 °C. Wanneer de PDMS-stempel is uitgehard, snijdt u de stempel van de master los en trimt u deze op de juiste maat.

Bewaar de stempel met de actieve zijde naar boven in een afgesloten container om deze te beschermen tegen stof en vuil. Om de substraten voor metaaldepositie voor te bereiden, worden ronde glazen dekglasjes eerst 10 minuten behandeld met zuurstofplasma. Spoel de dekglasjes vervolgens twee keer af met gedeïoniseerd water, waarbij tussen de spoelgangen wordt gedroogd met een stroom nitrogengas; spoel na het afspoelen met water nog twee keer af met ethanol, opnieuw met drogen met een stroom nitrogengas tussen de spoelbeurten.

Deposit met een electronenstraal-depositiesysteem met meerdere pockets 50 angstroms titanium, gevolgd door 150 angstroms goud. Ventileer de evaporator niet tussen de depositie van de titaniumlaag en de goudlaag. Spoel de PDMS-stempel met ethanol en droog deze grondig.

Breng met stikstofgas druppelgewijs de stempeloplossing aan op de stempel totdat deze volledig is bedekt. Droog de stempel grondig met stikstofgas. De microcontactprint van de HEXA Decaan-film is afhankelijk van de kenmerken van de PDMS-stempel en is een van de moeilijkste aspecten van deze procedure.

Voor een succesvolle afdruk is de ontwikkeling van een goede techniek nodig waarmee een gelijkmatige druk kan worden uitgeoefend. Tijdens het afdrukken: druk bij conventionele microcontactdruk in lucht de stempel voorzichtig op het gouden substraat en laat de monolaag gedurende 15 seconden vormen.

Als alternatief, voor patronen bestaande uit zeer kleine kenmerken en hoge aspectratio's, plaatst u het gouden substraat in een petrischaal met 18.2 mega om gedeïoniseerd water, waarbij u erop let dat het substraat volledig is ondergedompeld. Druk vervolgens de stempel voorzichtig op het gouden substraat en laat de monolaag 15 seconden lang vormen. Spoel het gestempelde substraat daarna twee keer af met ethanol en droog het met stikstofgas.

Plaats het substraat na elke spoeling in een Petrischaal en bedek het substraat met backfilling-oplossing. Sluit de schaal af met param om verdamping te voorkomen. Laat de achtergrondmonolaag 12 tot 14 uur in het donker vormen.

Verwijder tot slot het gepatroneerde dekglas uit de vullingsoplossing voor de achterzijde en spoel dit tweemaal met ethanol, waarbij na elke spoelgang wordt gedroogd met stikstofgas. Om proteïne aan het gepatroneerde dekglas aan te brengen, plaatst u het dekglas in een kleine Petrischaal of een celkweekkamer. Bedek dit met 500 µL tot 1 mL DPBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium). De DPBS moet het substraat tijdens de proteïne-incubatie volledig bedekken.

Voeg voor een gelijkmatige eiwitbedekking een geconcentreerde eiwitoplossing toe aan de DPBS en meng de oplossing door meerdere keren te pipetteren. Incubeer het eiwitmengsel met het substraat gedurende één uur bij 37 °C. Spoel het substraat na de incubatie grondig met DPBS om ongebonden eiwit te verwijderen, waarbij u er op let dat het substraat niet uitdroogt of door de lucht-watergrensvlak wordt gevoerd.

Zuig na drie spoelingen de DPBS af. Voeg vervolgens ongeveer 500 microliters comple celgroeimedium toe om het substraat vochtig te houden. Vervang het groeimedium dat is gebruikt om het substraat te spoelen.

Met vers medium is het substraat nu klaar voor het uitplaten van cellen. Doorgaans worden er 30 tot 200 cellen per vierkante millimeter op het substraat geplaatst. Deze afbeelding toont een A-P-D-M-S-stempel gevisualiseerd onder een microscoop door de stempel met de functionele zijde naar beneden op een glazen dekglas te plaatsen; de schaalbalk is 100 micrometers.

Correct stempelen resulteert in een scherp, duidelijk eiwitpatroon dat gevisualiseerd kan worden door het aanbrengen van een fluorescent gelabeld eiwit, zoals LOR 6 47 gelabeld fibronectine. De beperking van chk one-cellen tot het eiwitpatroon wordt hier getoond. De schaalbalken in deze afbeeldingen zijn 100 micrometers.

Als alternatief kan immunohistochemie worden gebruikt om het eiwitpatroon na SU-fixatie te visualiseren. Hier wordt een LOR three 50-geconjugeerd anti-laminine-antilichaam gebruikt om het patroon van laminine te visualiseren waarop E 18 muis-hippocampale neuronen zijn gezaaid, weergegeven na vier dagen in vitro. E 18 muis-hippocampale neuronen gekleurd met MIT tracker red five 80 laten zien dat de celgroei goed beperkt blijft tot het eiwitpatroon. Hoewel deze techniek gemakkelijk onder de knie te krijgen is, kunnen er verschillende veelvoorkomende problemen optreden, zoals geïllustreerd door deze preparaten van patroonsubstraten gevisualiseerd door LOR 6 47-geconjugeerde fibronectine-absorptie.

Het aanbrengen van proteïne zonder voldoende menging van de geconcentreerde proteïne-oplossing in de DPBS kan leiden tot ongelijkmatige proteïnepatronen. Onjuist stempelen kan leiden tot gedeeltelijke patroonoverdracht of het inklappen van de stempel. Daarnaast kan het blootstellen van het patroonsubstraat met geabsorbeerde proteïne aan de lucht de monolaag verstoren, wat leidt tot een verminderde resistentie.

Op de achtergrond kan ondergedompelde patroonvorming patronen produceren met kleine structuren die moeilijk te printen zijn via conventionele microcontactprinten en in lucht. Deze twee afbeeldingen tonen verschillende regio's van hetzelfde patroon, geprint met dezelfde PDMS-stempel in lucht of gedeïoniseerd water; ondersteuningslijnen zijn getoond in de afbeelding links om aan te tonen dat alleen de kleine structuren van het patroon niet succesvol zijn geprint. De schaalbalken zijn 20 micrometers. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in 18 tot 24 uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een patroonsubstraat vervaardigt. Maak een PDMS-stempel. Gebruik microcontactprinten om een gepatroneerd gouden substraat voor te bereiden en visualiseer dit patroon met behulp van eiwitten en cellen.