Vasodilatatie van geïsoleerde Schepen en de isolatie van de extracellulaire matrix van Tight-skin Muizen
24 maart 2017
We beschrijven de isolatie van de extracellulaire matrix van het hart van C57Bl/6J controlemuizen, muizen met een strakke huid en muizen met een strakke huid behandeld met het IRF5 remmende peptide. We beschrijven ook de vasodilatatiestudies op de geïsoleerde vaten van C57Bl/6J, muizen met een strakke huid en muizen met een strakke huid behandeld met het IRF5 remmende peptide.
Het algemene doel van deze procedures voor de isolatie van de extracellulaire matrix en ex vivo vasodilatatie is het bestuderen van de behandeling met het IRF5-remmende peptide bij knaagdieren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de vraag hoe veranderingen in de extracellulaire matrix de progressie van een ziekte kunnen versterken of verminderen. Het belangrijkste voordeel van de vasodilatiestudies is dat ze ons inzicht geven in in vivo processen zonder dat alle signaalcomponenten in overweging genomen hoeven te worden.
De isolatie van de extracellulaire matrix van het hart kan worden toegepast op andere organen, zoals de achterpoot of de long. We kregen dit idee toen we ons begonnen te richten op de duplicatie van fibrilline 1 in de tight skin-muis en de impact van een veranderde extracellulaire matrix en celgedrag erkenden. Nadat de muis is geanestheseerd en is voorbereid voor de operatie, opent u de huid met een schaar.
Snijd voorzichtig van de borst naar de zijkant van het kaakbeen, waarbij u erop let dat het onderliggende weefsel aan de voorzijde van de kaak niet wordt verstoord. Dissecteer vervolgens de arteria fascialis door het omliggende zachte weefsel te verwijderen. Wees hierbij voorzichtig om beschadiging van de slagader te voorkomen.
Bad het blootgelegde weefsel in MOPS-buffer om de vitaliteit te behouden. Zodra de arteria fascialis volledig is blootgelegd, grijpt u de arteria fascialis proximaal van de eerste bifurcatie, distaal van de plek waar de arterie zal worden doorgesneden. Snijd deze vervolgens los van de moederarterie en houd de arteria fascialis vast met de pincet.
Knip de twee takken die van de fascialis aftakken af en til het vat vervolgens voorzichtig op terwijl de verbindingen met het omliggende weefsel worden doorgesneden totdat de bifurcatie is bereikt. Knip bij de bifurcatie beide dochterarteriën door om het vat vrij te maken en breng het over naar een schaal met mops-buffer, waar het gehydrateerd blijft tot het nodig is. Om vaatverwijding te meten, dient u eerst voorbereidingen te treffen om de vaten te canuleren.
Vul glazen pipetten met een diameter van 125 tot 175 micron aan de punt volledig met MOPS-buffer. Vul daarnaast de oplossingreservoirs met MOPS. Cannuleer vervolgens de geïsoleerde vaten.
Bind ze aan glazen pipetten met behulp van ooghechtmateriaal. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de pipetten ontstaan. Plaats vervolgens de vatkamers op een omgekeerde microscoop met een videocamera-accessoire.
Voer de video uit via het video-schuifmaatmeetsysteem voor een schermmeting van de vaten. Zet de vaten nu onder druk met behulp van een proces in twee stappen. Til eerst de met mops gevulde reservoirs op tot een hoogte die een druk van 20 millimeters kwik boven het vat geeft.
Open de leiding met de mops naar het vat. Terwijl het vat onder druk wordt gezet, moet u controleren op tekenen van lekkage rond de verbindingen en over de gehele lengte van het vat. Als er geen lekken worden gevonden, verhoog dan de reservoirs om een druk van 60 millimeters kwik te genereren.
Controleer vervolgens de vaten opnieuw op lekken. Zodra de druk zonder lekken wordt gehandhaafd, laat u het vat 30 minuten equilibreren bij deze druk. Nadat de equilibratie is voltooid, meet u de vaatverwijding als reactie op een verbinding van belang.
Vernauw het bloedvat eerst met een halve tot driekwart door U46619 toe te voegen. Laat de vaten zes minuten in de oplossing baden om te stabiliseren. Voeg vervolgens geleidelijk de testverbinding, zoals acetylcholine, toe aan de badoplossing.
Verhoog elke twee minuten de concentratie van de testoplossing in het bad met 10, beginnend bij 000001 molar en oplopend tot 001 molar. De veranderingen in vasodilatatie riepen vragen op over signalering. Maar onze focus ligt op het hart.
Om het gebruik van dieren te verminderen, hebben we ervoor gekozen om de cardiale extracellulaire matrix te isoleren om ons te concentreren op de signalering die van buitenaf wordt geïnitieerd. Begin met het wegnemen van het hart van een geanestheseerde muis. Breng dit over naar een bekerglas gevuld met 15 milliliters hypertoon één procent natriumlaurylsulfaat.
Houd de oplossing 18 uur lang zachtjes roerend op een roerplaat bij kamertemperatuur. Vervang de oplossing de volgende dag door 15 milliliters van 5 procent triton X100 gedurende 30 minuten, gevolgd door 15 milliliters PBS gedurende 15 minuten. Vries vervolgens de ECM en vloeibare stikstof snel in in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis.
Zodra het weefsel is ingevroren, wordt dit overgebracht naar een vooraf gekoelde vijzel en stamper en tot een poeder vermalen. Suspendeer het poeder in een viskeuze oplossing van PBS waaraan antibiotica zijn toegevoegd in een concentratie van 1:100. Sonicate de suspensie gedurende 30 tot 60 seconden in een ijsbad bij een hoge sonication-instelling.
Het ECM-eiwit is nu geïsoleerd en moet koud blijven. Meet vóór gebruik de concentratie van het eiwit met een Bradford-assay. Het IRF5D-peptide is een inhiberend peptide dat sterk verschilt van normaal IRF5.
IRF5D bestaat uit slechts 17 aminozuren en bindt aan de fosforyleringsplaats van IRF5. Dit voorkomt fosforylering en homodimerisatie, waardoor de vorming van de actieve staat van IRF5 wordt gehinderd. Heterozygote tight skin-muizen werden gedurende drie weken subcutaan behandeld met IRF5D.
Het aantal neutrofielen en CD64 was verlaagd, zoals bepaald via immunohistochemie aan de hand van het gemiddelde aantal gekleurde cellen per gezichtsveld. Behandelingen met IRF5D verbeterden de acetylcholine-geïnduceerde vaatverwijding van de fascialis-slagaders in heterozygote tight skin-muizen die met IRF5D waren behandeld, in vergelijking met muizen die waren behandeld met fosfaatbuffer. In gecultiveerde myocyten, afgeleid van het hartweefsel van de transgene muizen, waren er meer IRF5-positieve cellen in culturen van heterozygote tight skin-muizen dan in controlemuizen.
Behandeling van beide culturen met IRF5D resulteerde in een vermindering van IRF5-positieve kernen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een hart kunt decellulariseren. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze worden overgedragen naar veel organen en helpen bij het beantwoorden van diverse vragen. En onthoud dat het belangrijk is om de matrix niet te oververteren.
U dient daarnaast een goede beheersing te hebben van het dissekeren en ophangen van de arteria fascialis. Eenmaal onder de knie, zou deze techniek ongeveer 60 minuten in beslag nemen en kan deze voor vrijwel elk vasculair bed worden toegepast. Het is belangrijk om te onthouden hoe fragiel het endotheel is; ga voorzichtig te werk tijdens de dissectie.
Het komt regelmatig voor dat er sprake is van gezonde gladde spieren en een beschadigd endotheel.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft de isolatie van de cardiale extracellulaire matrix uit diverse muismodellen en de daaropvolgende vasodilatatiestudies. De focus ligt op het begrijpen van de effecten van behandeling met een IRF5-remmend peptide op de progressie van de ziekte.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Cardiovasculaire biologie
- Onderzoek naar de extracellulaire matrix
Achtergrond
- De isolatie van de extracellulaire matrix is cruciaal voor het bestuderen van de rol ervan bij ziekten.
- IRF5 is betrokken bij de progressie van bepaalde ziekten.
- Tight-skin muizen vertonen veranderde eigenschappen van de extracellulaire matrix.
- Vasodilatatiestudies geven inzicht in de vasculaire functie.
Doel van het onderzoek
- Het isoleren van de cardiale extracellulaire matrix voor verdere analyse.
- Het evalueren van de impact van het IRF5-remmende peptide op vasculaire responsen.
- Het begrijpen van hoe veranderingen in de extracellulaire matrix de ziekteprogressie beïnvloeden.
Gebruikte methoden
- Isolatie van de cardiale extracellulaire matrix uit muismodellen.
- Ex vivo vasodilatatiestudies op geïsoleerde vaten.
- Vergelijking van responsen tussen controlemuizen en behandelde muizen.
- Chirurgische preparatie van muizen voor matrixisolatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van de extracellulaire matrix van het hart uit verschillende muizenstammen.
- Vasodilatatieresponsen varieerden tussen de controlegroep en muizen behandeld met IRF5-peptide.
- Verkregen inzichten in de rol van de extracellulaire matrix bij de vasculaire functie.
- Potentiële toepassingen van de isolatiemethode op andere organen.
Conclusies
- De studie benadrukt het belang van de extracellulaire matrix voor de cardiovasculaire gezondheid.
- Behandeling met een IRF5-remmend peptide is veelbelovend voor het modificeren van vasculaire reacties.
- Verder onderzoek is nodig om de implicaties voor ziektebehandeling te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Deze methode maakt mechanistische risicoreductie van IRF5 als therapeutisch doelwit mogelijk door remodeling van de extracellulaire matrix te koppelen aan vasculaire dysfunctie bij inflammatoire fibrose. De ex vivo vasodilatatie-assay biedt kwantitatieve, reproduceerbare resultaten van de endotheelfunctie, onafhankelijk van systemische storende factoren, wat de doelwitvalidatie in preklinische modellen ondersteunt. Isolatie van ziekterelateerde extracellulaire matrix faciliteert fenotypische screening en pathway-verduidelijking voor de ontdekking van antifibrotische geneesmiddelen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt de therapeutische hypothese dat IRF5-inhibitie de pro-inflammatoire signalering en de depositie van de extracellulaire matrix bij tight-skin-muizen vermindert.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door de meting van de nucleaire translocatie van IRF5 en de downstream ICAM-expressie in cardiale myocyten.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door het aantonen van een verbeterde endotheliale vasodilatatie als functionele biomarker van target-engagement.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Geïsoleerde cardiale extracellulaire matrix biedt een gestandaardiseerd, ziekterellevant systeem voor het evalueren van de effecten van verbindingen op celgedrag en signalering.
- Kwantitatieve output: Ex vivo vasodilatatiemetingen met behulp van acetylcholine dosis-respons curven maken een nauwkeurige beoordeling van de endotheelfunctie in geïsoleerde facialis-arteriën mogelijk.
- Hergebruik van platform: Het ECM-isolatieprotocol kan worden overgebracht naar het achterpoten-, long- of andere vasculaire bedden om cross-organ target-validatie te ondersteunen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor de ziekte: Maakt gebruik van het tight-skin muismodel, dat fibrose en vasculaire dysfunctie vertoont die analoog zijn aan menselijke sclerodermie.
- Translationele continuïteit: Verbindt IRF5-inhibitie met verminderde veranderingen in de extracellulaire matrix en verbeterde vasodilatatie, wat bijdraagt aan de mechanistische risicoreductie voor klinische translatie.
- Nut van het preklinische model: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door een target-gemedieerde verbetering van de vasculaire functie aan te tonen na chronische subcutane dosering.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie tot preklinische beoordeling van de werkzaamheid, wat het iteratieve ontwerp van IRF5-modulerende verbindingen mogelijk maakt op basis van vasculaire en matrixfenotypen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door de extracellulaire matrix te isoleren om outside-in signaling te bestuderen die IRF5-activatie en pro-inflammatoire responsen aanstuurt.
- Screening: Levert assay-klare vasculaire weefsels met reproduceerbare vasodilatatie-responsen voor het evalueren van de potentie en selectiviteit van verbindingen.
- Analytiek: Biedt kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele (veranderingen in vatdiameter) en statistische outputs (EC50, vasodilatatie %) om behandelingseffecten tussen groepen te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire target-engagement (nucleaire reductie van IRF5) met uitkomsten op weefselniveau (ECM-remodellering) en functionele verbetering (vasodilatatie) in een ziekte-relevant systeem.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor het bestuderen van interacties tussen de extracellulaire matrix en het vasculair systeem in meerdere orgaansystemen en ziekteverschijningsvormen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door vasculaire functie te isoleren van systemische variabelen, wat het vertrouwen in relaties tussen target en ziekte vergroot.
- Operationele waarde: Standaardiseert procedures voor vasodilatatie en ECM-isolatie, wat de reproduceerbaarheid tussen laboratoria verbetert en crossfunctionele samenwerking mogelijk maakt.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door target-inhibitie te koppelen aan functionele vasculaire uitkomsten, waardoor biologische risico's in een laat stadium bij fibroseprogramma's worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van IRF5-gerichte therapieën mogelijk op basis van aangetoonde verbetering in endotheliale functie en matrixhomeostase.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microvasculaire dissectie, drukmyografie en biochemie van de extracellulaire matrix.
- Is afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder videocalipersystemen, omgekeerde microscopen en drukreservoirs voor vasodilatatiestudies.
- Necessiteert standaardisatie van weefselverwerking, buffersamenstelling (MOPS) en contractieprotocollen (U46619 pre-constrictie) om de vergelijkbaarheid van gegevens te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het toepassen van ECM-isolatie op niet-cardiale weefsels, inclusief optimalisatie van decellularisatieragentia (SDS, Triton X-100) en de tijdsduur.
- Praktische beperking: De fragiliteit van het geïsoleerde endotheel vereist een nauwkeurige techniek om mechanische schade tijdens vaten canulatie en onderdrukking te voorkomen.
