Immunohistochemie op paraffine secties van Mouse Opperhuid gebruik van fluorescerende antilichamen

In de epidermis. Immunohistochemie is een efficiënte methode om specifieke eiwitten te lokaliseren in hun expressiecompartiment. In deze video demonstreren we een betrouwbare methode voor de immunolokalisatie van eiwitten in de epidermis, die wij routinematig in ons laboratorium gebruiken.

Hallo, ik ben Tammy van het laboratorium van Dr. Turin hier in het lage gebouw van het Ottawa Health Research Institute in het programma voor chronische ziekten. Vandaag tonen we u een procedure voor immunohistochemie met gebruik van fluorescerende antilichamen op paraffine-ingebedde weefselcoupes van muisepidermis. In ons laboratorium hebben we protocollen geoptimaliseerd voor de immunolokalisatie van epidermale differentiatiemarkers met gebruik van BO'S-gefixeerd weefsel.

Als onderdeel van de optimalisatie houden we de huid vlak door deze op keukenpapier uit te leggen vóór de fixatie. Deze procedure omvat dissectie van de epidermis, fixatie, dehydratatie, inbedding in paraffine en het snijden van secties, gevolgd door ontwaxen, rehydratatie, antigen-unmasking, antilichaamlabeling en tot slot montage en visualisatie met epifluorescentie. Laten we beginnen.

Bij het gebruik van neonatale muizen is het niet nodig om de huid op de rug te scheren. Echter, bij oudere muizen met vacht moet de huid op de rug worden geschoren, zodat het haar het snijden van de secties niet belemmert. Tijdens de dissectie moet u er zeer zorgvuldig op toezien dat u met de pincet niet in de huidgebieden komt die u voor uw assay wilt gebruiken.

Wat we nu doen, is de pincet rond de rand plaatsen van waar we gaan snijden, en dan heel voorzichtig optillen en de epidermis doorsnijden, waarbij u er op moet letten dat u het gebied dat u voor uw experiment wilt gebruiken niet aanraakt. Wanneer we de huid fixeren, willen we niet dat de huid oprolt en zo in de buis terechtkomt. We willen dat deze mooi plat ligt.

Om dit te vergemakkelijken, leggen we de huid op een papieren handdoek zodat deze vlak blijft tijdens de fixatie. Nu de huid netjes en vlak op de papieren handdoek ligt, snijden we de randen af of trimmen we deze om de delen te verwijderen die mogelijk met de pincet zijn beschadigd. Vervolgens snijdt u de huid in zeer kleine stukjes van ongeveer 2 millimeter bij 2 millimeter.

Nu zal het weefsel worden gefixeerd. Nadat de huid in hanteerbare stukken is gesneden, dompelt u deze onder in de boin-oplossing. Sluit de buisjes af, wikkel de buisjes in parafilm en plaats ze op een rocker.

Voor een incubatie overnacht is het belangrijk om slechts 16 tot 18 uur in de boin-oplossing te incuberen. Kortere of langere fixatieperioden zullen het weefsel beschadigen. De incubatie is voltooid.

U spoelt het weefsel met PBS en vervolgens met een reeks ethanolwasbeurten met 30%, 50% en 70% alcohol. U kunt zien dat de BO geel van kleur is en dat naarmate de wasbeurten worden uitgevoerd en de BO wordt verdund, de kleur van het wasmiddel steeds minder geel wordt. U wast twee keer, telkens gedurende 30 minuten.

Na de laatste wasbeurt in ethanol worden de monsters geplaatst in verse 70% ethanol en kunnen ze bij vier graden Celsius worden bewaard tot verdere verwerking van de paraffine-inbedding. Bij het gebruik van bevroren weefsels is de weefselintegriteit superieur en kunnen monsters gedurende lange perioden worden bewaard. In het algemeen leveren kernfaciliteiten meer reproduceerbare resultaten op.

Indien u echter over de faciliteiten beschikt en een toegewezen operator met de nodige expertise heeft, kunnen coupes intern worden vervaardigd. Het leren snijden van kwalitatieve coupes is vrijwel een kunstvorm. Daarom maken wij gebruik van een kernfaciliteit.

Nadat u de coupes heeft teruggekregen van de Core facility, zult u zien dat er paraffine op de coupes aanwezig is. Terwijl de paraffine als een dunne film aanwezig is, worden de coupes geplaatst op een rek dat is ingepakt in aluminiumfolie, vergelijkbaar met een gebakken aardappel, en gedurende vijf minuten geïncubeerd bij 55 °C. Na afloop van de incubatie pakt u de coupes snel uit en plaatst u deze in tolueen voor drie wasbeurten van vijf minuten.

Het is zeer belangrijk om te onthouden dat deze wasbeurten van vijf minuten nauwkeurig getimed moeten worden; te lange incubatie en tolueen zullen nadelig zijn voor uw specimens. Voer na de drie wasbeurten en de behandeling met tolueen een snelle spoeling uit in 100% ethanol. Aangezien ethanol en tolueen een neerslag vormen die uw experiment zal verstoren, is dit een zeer belangrijke stap om te onthouden.

Vervolgens worden de monsters gerehydrateerd door de coupes vijf minuten te incuberen in 95% ethanol, vijf minuten in 70% ethanol en daarna twee keer vijf minuten in water. Op dit punt kunnen de weefsels worden verwerkt voor H&E-kleuring. We maken hiervoor ook gebruik van de core facility.

Giet voor het onmaskeren van antigenen 500 ml eenmalige citraatbuffer in een plastic bekerglas van één liter en dompel de coupes hierin onder. Vergeet niet om het metalen handvat te verwijderen voordat u het bekerglas in de magnetron plaatst. Verhit in de magnetron op hoog vermogen tweemaal gedurende vijf minuten.

Vergeet niet de deur te openen om de magnetron af te koelen tussen de twee incubaties door. Wanneer het verhitten in de magnetron is voltooid, haalt u de objectglazen uit de kokende citraatbuffer en plaatst u deze in een kleurbak met warm water. Wij gebruiken hiervoor gewoon warm kraanwater; het doel hiervan is om de objectglazen langzaam af te koelen van het kookpunt naar kamertemperatuur.

Nu kunt u de objectglazen drie keer vijf minuten wassen in PBS en we zijn klaar om te beginnen met de immunohistochemie. Het eerste wat we moeten doen om te starten met de immunokleuring is het gebied rondom onze monsters drogen met een stukje keukenpapier. Om kruiscontaminatie van antilichamen te voorkomen, bakenen we het gebied rondom onze monsters af met een vloeibare blocker.

Bereid een bevochtigingskamer voor door een filterpapier in een Petrischale te plaatsen. Maak dit nat met water, verwijder het overtollige water en plaats de preparaten erin. De reden voor het gebruik van een bevochtigingskamer is om ervoor te zorgen dat de preparaten tijdens de incubatieperioden niet uitdrogen.

Het is zeer belangrijk dat de objectglazen niet uitdrogen, omdat dit de achtergrondruis bij het tekenen zal verhogen. De objectglazen worden op dit moment gedurende 30 minuten geblokkeerd met incubatiebuffer. Plaats de objectglazen na het blokkeren terug in het objectglazenrek en incubeer ze in wasbuffer.

Verwijder het overtollige buffer zoals u dat eerder deed. Plaats de slide terug in de bevochtigingskamer en incubeer gedurende één uur met het primaire antilichaam. Bij kamertemperatuur.

Wanneer de incubatie van één uur is voltooid, plaatst u de coupes terug in het objectglashouderrek en wast u deze drie keer 10 minuten met wasbuffer. Verwijder na het wassen het overtollige wasbuffer rondom het preparaat met een papieren tissue. Plaats de coupes terug in de bevochtigingskamer en incubeer deze één uur bij kamertemperatuur met het secundaire antilichaam. Na incubatie met het secundaire antilichaam wast u de coupes drie keer 15 minuten met telkens verse wasbuffer.

Vervolgens wassen we drie keer vijf minuten. Verwijder in PBS alle overtollige vloeistoffen rondom het preparaat en veeg de PBS van de achterkant van het objectglas om dekglasplaatjes op het objectglas te monteren. We gebruiken mobiel met 2,5% DAB co.

Voeg om vervaging te verminderen 80 µL druppelsgewijs toe aan de objectglazen. Wees voorzichtig om geen luchtbellen te introduceren. Laat vervolgens zeer langzaam een dekglas zakken.

Zorg ervoor dat er geen luchtbellen achterblijven. Luchtbellen zijn ongewenst omdat ze vaak precies op uw preparaat terechtkomen, precies op de plek waar u foto's wilt maken zodra uw telefoon droog is. U kunt nu uw preparaten bekijken.

Hier is een weergave van een succesvolle kleuring met behulp van een FITC-filter. Bij een 20 x objectief zien we Claudine 6 geassocieerd met alle superbasale lagen van de epidermis. Ons laboratorium is zeer geïnteresseerd in de expressie en lokalisatie van claudines in de epidermis.

Wat betreft de tight junctions en de vorming van de epidermale permeabiliteitsbarrière, hebben we zojuist gedemonstreerd hoe immunohistochemie op muizenhuid wordt uitgevoerd. Bij deze procedure is het belangrijk om eraan te denken dat de weefselcoupes vlak moeten liggen en dat u ervoor zorgt dat de objectglaasjes tussen de incubaties door niet uitdrogen. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.