Multimeer-PAGE: Een methode voor het vastleggen en oplossen eiwitcomplexen Biological Samples
5 mei 2017
Een werkwijze voor het stabiliseren en scheiden van natieve eiwitcomplexen van ongewijzigd weefsellysaat onder toepassing van een amino-reactieve eiwit-crosslinker gekoppeld aan een nieuw tweedimensionaal polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) systeem wordt gepresenteerd.
Het algemene doel van dit protocol is om onderzoekers in staat te stellen native eiwitcomplexen te vangen, scheiden en analyseren die zijn geëxtraheerd uit weefsellysaten met behulp van polyacrylamidegelelektroforese. Deze methode kan onderzoekers die eiwitten bestuderen helpen omdat het in staat is om anders labiele eiwitassociaties te stabiliseren onder bijna-native omstandigheden, waardoor hun identificatie en daaropvolgende analyse mogelijk wordt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gebruik maakt van veelvoorkomende biologische methoden, dus het is wijd toepasbaar en kan worden aangepast aan de doelen van de individuele onderzoeker.
Om deze procedure te beginnen, bereid de blue native polyacrylamide gelelektroforese voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Verbind de elektroden met de stroomvoorziening en elektroforiseer de eiwitten in de gel bij 150 volt totdat de kleurband ongeveer twee centimeter in de oplossende laag is gevorderd. Op dit punt, stop en ontkoppel de stroomvoorziening.
Nadat het elektroforeseapparaat is gedemonteerd, scheid de glazen panelen van de gelcassette. Verwijder en gooi de staplagen weg. Snijd voorzichtig de gel net onder de onderrand van de kleurfront, zorg ervoor dat deze snede zo glad en recht mogelijk is.
Gooi vervolgens het ongebruikte stuk gel weg. Verwijder ongebruikte delen langs de randen van de gelstrip. Plaats de strip voorzichtig in 10 milliliter fosfaatgebufferde zoutoplossing in een klein bakje en meng voorzichtig door middel van notatie gedurende 30 minuten om te gelijkmaken.
Na het gelijkmaken, gooi de PBS weg en vervang het door nog eens 10 milliliter. Pipetteer 500 microliter van 25 millimolair DSP opgelost in dimethylsulfoxide in de PBS en blijf mixen zoals voorheen gedurende 30 minuten. Na 30 minuten, giet de DSP-oplossing weg.
Bij 10 milliliter van 0,375 molair HSCL, pH 8,8, met 2% natriumdodecylsulfaat om het ongereageerde DSP te doven. Blijf noteren gedurende 15 minuten. Terwijl de gelstrip wordt gedood, bereid de SDS-PAGE geloplossingen volgens standaardmethoden voor.
Voeg de polymerisatiereagentia niet toe. Na het doven, breng de blue native gelstrip terug naar kamertemperatuur en giet de strip in een nieuwe gelcassette. Om dit te doen, pak de gel voorzichtig op en plaats hem op een schone gelcassette ruimteplaat.
Oriënteer de strip zodat deze van zijn vorige oriëntatie wordt omgedraaid en de onderkant van de kleurfront het dichtst bij de bovenkant van de nieuwe cassette is. Plaats de strip zodanig dat de bovenrand gelijk ligt met waar de bovenrand van de dekplaat zal zijn. Zorg ervoor dat de kleurfront evenwijdig is aan de horizontale randen van de glazen plaat.
Duwt een kant van de uitgesneden strip tegen een van de ruimtewanden, waarbij aan de andere kant ruimte wordt gelaten voor de gel te gieten en een eiwitstandaard of ladder te laden. Als de onderrand van de gelstrip enige ruwe of ongelijke gebieden bevat, knip deze voorzichtig weg. Zodra de gelstrip correct is gepositioneerd, leg de dekplaat over de ruimteplaat.
Oefen lichte druk uit om eventuele vastzittende luchtbellen uit te duwen. Ga door met het assembleren van het gel-gietapparaat volgens de instructies van de fabrikant. De gelstrip verschuift soms wanneer de bovenplaat wordt geplaatst.
Het helpt om de strip een beetje over de rand van de bovenplaat te laten hangen, zodat deze kan worden aangepast met een spatel om eventuele verschuivingen te corrigeren. Voeg polymerisatiereagentia toe aan de oplossende gelbuffer en giet het in de voorbereide gelcassette met behulp van een serologische pipet. Vul de gelcassette tot ongeveer twee centimeter onder de uitgesneden blue native PAGE gelstrip om ruimte te laten voor de staplagen.
Voeg vervolgens 100 microliter butanol toe over de bovenkant van de gegoten gel en laat 30 minuten staan voor polymerisatie van de oplossende laag voordat u het butanol afgiet. Voeg vervolgens de polymerisatiereagentia toe aan de staplagenoplossing. Giet met behulp van een serologische pipet de staplagen om alle resterende lege ruimte in de gelcassette te vullen.
Kanteel de gelcassette terwijl de staplaag wordt gegoten, zodat deze de ruimte onder de gelstrip vult en er geen luchtbellen worden vastgehouden. Terwijl de staplaagbuffer de lege ruimte onder de gelstrip vult, breng de gelcassette geleidelijk terug naar een vlakke voet. Blijf de lege ruimte naast de uitgesneden gelstrip vullen met de staplaagbuffer tot het bijna overstroomt.
Laat vervolgens de staplaag 30 minuten polymeriseren. Nadat de staplaag is gepolymeriseerd, verwijder de gelcassette van het gietapparaat, spoel deze af met gedestilleerd water en assembleer het elektroforeseapparaat volgens de instructies van de fabrikant. Vul de binnenkamer volledig met 1x SDS-PAGE-loopbuffer.
Vul vervolgens de buitenste kamer tot het niveau dat door de fabrikant is aangegeven. Laad de ruimte naast de uitgesneden gelstrip met een moleculair gewichtsladder of de juiste eiwitstandaard. Bevestig de elektroden aan de stroomvoorziening en elektroforiseer de monsters bij 120 volt.
Wanneer de Coomassie-kleurstof uit de gel loopt, stop de run en ontkoppel de stroomvoorziening. Analyseer de gel met behulp van standaardmethoden voor elektroblotting en antilichaam-gebaseerde eiwitdetectie. Validatie van multimer-PAGE wordt hier getoond via immunoblot.
Het gevangen kinesincomplex wordt gesplitst door diphyo-3-itol, wat aantoont dat de hoge moleculaire gewichtsaggregaten worden gevormd door cross-linking van kleinere substituenten. Hier getoond, hersenlysaten behandeld met toenemende concentraties SDS of Triton verhoogden de detectie van monomere alpha-synucleïne terwijl de detectie van het oplosbare oligomeer tetromer afnam. Hier worden representatieve resultaten van multimer-PAGE getoond die worden gebruikt om oplosbare complexen in rattenhersenlysaat te vangen.
Eiwitten werden gedetecteerd via immunoblot. Het verwachte monomere gewicht van elk eiwit wordt onder de banen getoond. Evenzo wordt de opvang van membraangebonden complexen hier getoond.
Multimer-PAGE
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol presenteert een methode voor het stabiliseren en scheiden van natuurlijke proteïnecomplexen uit weefsellysaten met behulp van een nieuw tweedimensionaal polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) systeem. Het maakt de analyse van proteïneassociaties onder bijna-natuurlijke condities mogelijk.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Proteomics
- Elektroforese
Achtergrond
- Het begrijpen van proteïncomplexen is van cruciaal belang voor veel biologische studies.
- Natuurlijke proteïneassociaties kunnen labiel zijn en zijn moeilijk te analyseren.
- Veelgebruikte biologische methoden vergemakkelijken de toepassing van deze techniek.
- Deze methode maakt op maat gemaakte benaderingen voor proteïneanalyse mogelijk.
Doel van de studie
- Om natuurlijke proteïnecomplexen uit weefsellysaten op te vangen en te analyseren.
- Om proteïneassociaties te stabiliseren voor een betere identificatie.
- Om een breed toepasbare methode voor onderzoekers te bieden.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding voor blue native polyacrylamidegelelektroforese.
- Elektroforese van eiwitten bij 150 volt.
- Monitoring van de voortgang van de kleurband in de gel.
- Gebruik van een amine-reactieve eiwit-crosslinker.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle stabilisatie van native proteïncomplexen.
- Effectieve scheiding van proteïnen in weefsellysaten.
- Identificatie van proteïneassociaties onder bijna-native condities.
Conclusies
- Deze methode verbetert de analyse van proteïnecomplexen.
- Het is aanpasbaar aan diverse onderzoeksdoelen.
- Het gebruik van gangbare methoden vergroot de toegankelijkheid voor onderzoekers.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Multimeer-PAGE stelt biopharma R&D-teams in staat om native proteïnecomplexen uit weefsellysaten te stabiliseren en te scheiden onder bijna-native condities, wat targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. Door labiele proteïneassociaties te behouden die vaak verloren gaan bij conventionele zuivering, verbetert deze methode het voorspellend vertrouwen in pathway-analyse en de identificatie van complex-gebaseerde drugtargets. Deze benadering versterkt de translationele continuïteit van ontdekking tot preklinische evaluatie door reproduceerbare, kwantitatieve resultaten van complexvorming te leveren.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door natuurlijke eiwitinteracties vast te leggen zonder niet-covalente bindingen te verstoren.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van toegankelijke blue-native en SDS-PAGE technieken die bekend zijn bij de meeste moleculaire biologieteams, waardoor de behoefte aan gespecialiseerde training wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de functionele validatie van targets door complexen te stabiliseren voor downstream identificatie via immunoblot of massaspectrometrie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert opgeloste complexprofielen die kunnen dienen als kwantitatieve biomarkers voor assay-standaardisatie over verschillende screeningcampagnes heen.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van goedkope, algemeen beschikbare reagentia en apparatuur, wat schaalbare implementatie in kernfaciliteiten mogelijk maakt.
- Assay-gereedheid: Produceert via SDS-PAGE gescheiden complexen die compatibel zijn met downstream detectiemethoden zoals immunodetectie, wat de integratie van high-content screening ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen discovery- en preklinische workflows door de integriteit van complexen te behouden voor validatie in ziekterelevante systemen.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt beoordeling van complexvorming onder variërende omstandigheden mogelijk (bijv. blootstelling aan detergentia of SDS), wat inzicht geeft in de robuustheid van het target.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Maakt go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van de stabiliteit en abundantie van complexen, waardoor uitval in een laat stadium door mechanische onzekerheid wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
Multimer-PAGE past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetidentificatie tot leadoptimalisatie en vormt een mechanistische brug naar preklinische validatie door de analyse van native proteïncomplexen in monsters afgeleid van weefsel mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen en pathway-verduidelijking door endogene complexen vast te leggen uit ongemodificeerde weefsellysaten.
- Screening: Maakt assay-ontwikkeling mogelijk via reproduceerbare scheiding en detectie van complexen, wat de evaluatie van het effect van verbindingen op target-engagement faciliteert.
- Analytics: Levert kwantitatieve scheiding van proteïnecomplexen via secundaire SDS-PAGE, waardoor vergelijking van condities of behandelingen mogelijk is.
- Translationeel Onderzoek: Legt de verbinding met preklinische continuïteit door de stabiliteit van complexen te behouden voor validatie in ziektemodellen, wat de afstemming van biomarkers ondersteunt.
- Enterprise Hergebruik: Functioneert als een herbruikbare platformcapaciteit in plaats van een eenmalige assay, aanpasbaar voor meerdere targets en ziektegebieden.
Operationele en Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in proteïne-interactienetwerken te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie via gestandaardiseerde gel-gebaseerde workflows en bekende elektroforese-technieken.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van targets mogelijk te maken, waardoor investeringen in slecht gevalideerde mechanismen worden geminimaliseerd.
- Impact op de portfolio: Informeert risico-gecorrigeerde prioritering door direct bewijs te leveren van complexvorming en stabiliteit in native contexten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in native PAGE- en SDS-PAGE-technieken, inclusief het gieten van gels en elektroforetische scheiding.
- Is afhankelijk van toegang tot elektroforese-apparatuur, stroomvoorzieningen en standaardreagentia zoals DSP-crosslinker en SDS.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor consistente vastlegging en detectie van complexen over de discovery- en preklinische groepen heen.
- Houdt rekening met aanpassingen voor verschillende weefseltypen en complexgroottes, aangezien de scheidings 효율iteit kan variëren met het molecuulgewicht.
- Wordt beperkt door uitdagingen bij het oplossen van extreem grote complexen en potentiële variabiliteit in de crosslinking-efficiëntie, zoals vermeld in het bronmateriaal.
