Het gebruik van een β-lactamase gebaseerde Conductimetric Biosensor Assay voor het detecteren van biomoleculaire interacties

Het algemene doel van deze conductometrische biosensor-assay is het detecteren van biomoleculaire interacties met behulp van hybride bèta-lactamase-technologie. We beschrijven een methode om antilichaam-antigeeninteracties te detecteren met behulp van een chimeer bèta-lactamase-eiwit. Het principe van deze methode berust op het detecteren van binding door de protonenvrijgave van de bèta-lactamase-activiteit te meten.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele immunosensoren is het gebruik van een chimerisch bèta-lactamase, wat goedkopere en snellere sensor-assays mogelijk maakt door een hybride eiwit te gebruiken voor de detectie van analyten. De procedure zal worden gedemonstreerd door Mathieu Dondelinger, een promovendus. Begin deze procedure met de voorbereiding van eiwitmonsters en oplossingen zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid de herbruikbare elektrode voor door de uiteinden gedurende twee minuten in de putjes van een 96-wells plaat te dopen, die elk 300 microliters elektrode-preparatieoplossing bevatten, met voorzichtig mengen bij kamertemperatuur.

Herhaal deze stap drie keer. Spoel vervolgens de elektroden door de tips gedurende twee minuten bij kamertemperatuur met voorzichtig mengen te dompelen in wells van een 96-wellplaat die 300 microliters gedestilleerd water per well bevatten. Om de elektroden te regenereren, dompelt u de tips overnacht bij vier graden Celsius of één uur bij kamertemperatuur in wells van een 96-wellplaat die 300 microliters regeneratie-oplossing per well bevatten.

Voer vervolgens drie wasbeurten van de elektroden uit door de tips te dompelen in putjes van een 96-wellplaat die 300 µL fosfaatgebufferde zoutoplossing per putje bevatten. Voer elke wasbeurt twee minuten lang uit met voorzichtig mengen bij kamertemperatuur. Coat kippen-eiwitlysozym op het polyaniline-oppervlak van de elektrode door een druppel van 15 µL 40 µg/mL HEWL, bereid in fosfaatbuffer, op het elektrode-oppervlak aan te brengen.

Incubeer de elektrode één uur bij kamertemperatuur. Voer vervolgens drie wasbeurten van de elektroden uit met fosfaatbuffer door de elektrodegedeelten van de sensorchips te dompelen in een well van een 96-wellplaat die 300 µL fosfaatbuffer per well bevat. Voer elke wasbeurt twee minuten lang uit met voorzichtig mengen bij kamertemperatuur.

Verzadig de elektroden door een druppel van 30 µL blokkeringsoplossing op het oppervlak van de elektrode aan te brengen. Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens drie keer zoals voorheen.

Verdun de BlaP-cAb-Lys3- of BlaP-oplossingen tot 20 µg/mL in bindingsbuffer. Breng vervolgens een druppel van 15 µL van deze verdunde oplossing aan op de elektroden. Incubeer de elektroden gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Was na de reactie van het antigeen-nanobody de elektroden drie keer met wasoplossing. Was vervolgens de elektroden van de sensor in detectiebuffer door de elektroden te dompelen in een well van een 96-wellplaat met 300 microliters detectiebuffer per well. Incubeer vervolgens kort gedurende één minuut.

Sluit voor de detectie de digitale multimeter aan op de computer. Sluit vervolgens de sensorchip aan op de digitale multimeter via het koperen schakelingsgedeelte. Initieer de sensorrespons door een druppel van 50 µL benzylpenicilline-oplossing met een concentratie van 4 mM aan te brengen op de positief gelabelde elektroden.

Breng een druppel van 50 µL van de detectie-oplossing aan op de negatief gelabelde elektroden om als negatieve controle te dienen. Monitor de conductometrische waarden gedurende 30 minuten met de aangesloten digitale multimeter. Visualiseer de gegevens in realtime direct op het scherm, of exporteer de digitale gegevens als tekstbestand.

Deze ruwe gegevens kunnen worden uitgezet om een grafische weergave te creëren die de metingen van de conductiviteitsveranderingen tussen de referentie- en monsterelektroden ten opzichte van de tijd representeert. Om het chimerische eiwit te construeren, werd de klasse A bèta-lactamase BlaP als drager-eiwit gebruikt. Hier zijn de katalytische residuen in het rood weergegeven.

De insertieplaats, gelegen in een oplosmiddel-blootgestelde lus, is in het geel aangegeven. Het camelid antilichaamfragment genaamd cAb-Lys3 werd geïnsereerd in BlaP. Het resulterende chimere eiwit, BlaP-cAb-Lyse3, is in staat om HEWL te binden terwijl de bèta-lactamase-activiteit behouden blijft.

HEWL werd geïmmobiliseerd op een met polyaniline gecoate elektrode voordat BlaP-cAb-Lys3 werd geladen. De afgifte van protonen bij de hydrolyse van benzylpenicilline door het geïmmobiliseerde chimerische eiwit induceert conductiviteitsveranderingen die door de gebruiker kunnen worden geïnterpreteerd. De sensoren bevatten acht chips die zijn georganiseerd als vier paren.

Elke chip bevat drie elektroden: één polyaniline-gecoate werkelektrode, één referentie-elektrode en één tegenelektrode. Voor elk paar komt de chip met het label negatief overeen met een negatieve controle, terwijl de chip met het label positief overeenkomt met de geteste monster. Hier worden geleidingsmetingen getoond die de specifieke interactie van BlaP-cAb-Lys3 met HEWL aantonen.

De veranderingen in de geleidbaarheid zijn het gevolg van de protonafgifte die wordt veroorzaakt door antibiotica-hydrolyse door de geïmmobiliseerde chimerische bèta-lactamase. Er kon geen binding worden gedetecteerd voor de negatieve controle, de natuurlijke bèta-lactamase BlaP. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in een halve dag worden uitgevoerd, mits deze correct wordt uitgevoerd en de experimentele condities zijn geoptimaliseerd.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de insertie van een antilichaamsfragment in BlaP uitdagend is. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken dat de kwaliteit van de gegenereerde gegevens afhankelijk zal zijn van de functionaliteit van de chimerische bèta-lactamase. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd waarmee de gedetecteerde interactie gekwantificeerd kan worden, om zo de evenwichtsassociatieconstante van deze interactie te bepalen.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van immuunbiosensoren om moleculaire interacties te verkennen in diverse monsters, variërend van levende organismen tot verschillende omgevingen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de detectie van talrijke biomoleculen, aangezien de chimerische bèta-lactamase-technologie een veelzijdige tool is om elk antilichaam of eiwitfragment te functionaliseren. Daarom kan het worden gebruikt voor de ontwikkeling van goedkope en snelle diagnostische instrumenten in talrijke vakgebieden, zoals de menselijke en dierlijke gezondheidszorg.