Bacteriële Detection & Identification gebruiken elektrochemische sensoren

Het algemene doel van het volgende experiment is het detecteren en identificeren van bacteriën met behulp van elektrochemische sensoren. Dit wordt bereikt door in eerste instantie het ribosomaal RNA uit de bacteriën vrij te maken om hybridisatie met de gefluoreerde detectieprobe mogelijk te maken; als tweede stap wordt het aan de detectieprobe gebonden ribosomaal RNA toegevoegd aan de werkelektrode, wat hybridisatie met de vangprobe op het sensoroppervlak mogelijk maakt. Vervolgens krijgt het anti-fluoresceïne mierikswortelperoxidase-conjugaat de kans om te binden aan de gefluoreerde detectieprobe.

Ten slotte kan de interferometrische stroom worden verkregen, waarvan de intensiteit gecorreleerd is met het aantal complexen van capture probe ribosomaal RNA-detector probes op het sensoroppervlak. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van kweekgebaseerde methoden is dat bacteriën in ongeveer 45 minuten kunnen worden gedetecteerd en geïdentificeerd, waardoor het wachten tot de volgende dag om een zichtbare kolonie op een EDGAR-plaat te vormen, wordt vermeden. Toepassing van deze techniek zou het beheer van infectieziekten verbeteren.

Aangezien vroege detectie van bacteriële pathogenen essentieel is voor gerichte antibioticatherapie en verbeterde klinische uitkomsten, is deze methode nuttig voor de diagnose van infectieziekten, maar kan deze ook worden toegepast op andere diagnostische vraagstukken, zoals immunodiagnostiek. Begin met het incuberen van de verdunde capture-probe met hexaandithiol gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om te garanderen dat de thiolgroep op de capture-probe wordt gereduceerd, wat leidt tot consistenter resultaten.

Pas na de incubatie een stroom stikstof toe op de 16 sensor array-chips met goudlaag gedurende vijf seconden om eventueel vocht of minuscule deeltjes te verwijderen. Kleine volumes vloeistof moeten zorgvuldig worden aangebracht op de werkelektrode in de sensor array. Een visuele demonstratie van deze techniek is essentieel.

Aangezien het correct uitvoeren van de pipetteer-, was- en droogtechnieken de variabiliteit tussen de chips aanzienlijk vermindert, brengt u vervolgens zes microliters van de HDT verdunde capture probe mix aan op de werkelektrode van alle 16 sensoren van de sensorarray. Bewaar de sensorchips in een afgedekte Petrischaal bij vier graden Celsius gedurende de nacht. Was de sensorchips de volgende dag gedurende twee tot drie seconden met gedeïoniseerd water en droog de chips vervolgens vijf seconden onder een stroom stikstof. Breng nu zes microliters van de attri hydrochloride sodium chloride, EDTA MERCAPTOETHANOL oplossing aan op de werkelektrode van alle 16 sensoren en incubeer de sensoren gedurende 50 minuten in een Petrischaal bij kamertemperatuur.

Om de monsters voor de elektrochemische sensorsanalyse voor te bereiden, brengt u één milliliter bacteriële cultuur in de logaritmische groeifase over naar een microcentrifugebuis en centrifugeert u de cellen vervolgens vijf minuten bij 16,000 gs. Let op dat pathogene bacteriën in een biologische veiligheidskast gehanteerd moeten worden.

Na het verwijderen van de snat, brengt u met een pipetpunt 10 µL van een 1 M natriumhydroxideoplossing aan op de bodem van de microcentrifugebuis en pipetteert u dit enkele keren op en neer om het pellet grondig te resuspenderen. Na incubatie van de suspensie gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, voegt u 50 µL PBS toe dat bovine serum albumine of BSA en een fluoresceïne-gemodificeerde detectieprobe bevat om het bacteriële lysaat te neutraliseren. Incubeer vervolgens het geneutraliseerde lysaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Begin deze stap door de mercaptoethanol-oplossing van een van de voorbereide sensorchips twee tot drie seconden lang af te spoelen met gedeïoniseerd water. Nadat de chip is gedroogd zoals zojuist gedemonstreerd, brengt u vier µL van het geneutraliseerde bacterielysaat aan op de werkelektroden van 14 van de sensoren.

Breng vervolgens vier µL van het overbruggende oligonucleotide in PBS plus BSA plus fluoresceïne-gemodificeerde detecteursonde aan op de twee positieve controlesensoren. Was na incubatie van het lysaat en de positieve controlesensoren gedurende 15 minuten de gehele sensorschip en droog deze vervolgens zoals eerder beschreven. Breng nu vier µL anti-fluoresceïne paardenradijsperoxidase of HRP in PBS met caseïne aan op de werkelektroden van alle 16 sensoren.

Was en droog de sensorchip na een incubatie van 15 minuten. Plak vervolgens een film well-sticker op het oppervlak van de sensorchip en plaats de chip in de sensorchiphouder. Pipetteer 50 µL TMB-substraat op alle 16 sensoren en sluit de sensorchiphouder. Gebruik tot slot een Helios-chipreader om pyrometrie- en cyclische telemetriemetingen voor alle 16 sensoren te verkrijgen.

De zojuist beschreven elektrochemische assay is vergelijkbaar gestructureerd met een sandwich-ELISA, zoals in deze figuur wordt getoond; de hybridisatie van doelribosomaal RNA met capture- en detectorprobes wordt gedetecteerd via een redoxreactie gekatalyseerd door HRP geconjugeerd aan anti-fluoresceïne-antilichaamfragmenten die binden aan de fluoresceïne-koppeling op de detectorprobe. Een belangrijk onderdeel van de sensitiviteit van de assay is de oppervlaktechemie van de goudelektrode. De goudelektrode is gecoat met mercaptoethanol en hexanol en is gefunctionaliseerd door de toevoeging van verdunde captureprobes.

De sandwich-hybridisatie van het doelribosomaal RNA met de capture-probe en de fluoresceïne-gelabelde detector-probe resulteert in een complex dat wordt gedetecteerd door toevoeging van het anti-fluoresceïne mierikwortelperoxidase-conjugaat en het TMB-substraat. De M-parametrische stroom wordt gegenereerd door de redoxcyclus die voortvloeit uit de oxidatie van TMB door mierikwortelperoxidase en de reductie van TMB door de elektronen van de elektrode. De hier getoonde assays maken gebruik van een Gene Fluidic 16 sensor-array chip.

Elke sensor in de array bevat drie elektroden — een werkelektrode, een referentie-elektrode en een hulpelektrode — die contactpunten aan de rand van de chip hebben. De chipreader is voorzien van pogo-pinnen die verbinding maken met elk van de contactpunten. De chipreader dient als interface voor de sensorarray met een potentiometer die wordt aangestuurd door een computeralgoritme.

Hier worden voorbeelden van de stroomloop van een elektrochemische sensor getoond. De stroomloop in de sensoren is kunstmatig hoog tijdens de eerste paar seconden nadat de parametrische metingen beginnen. Vanwege de accumulatie van geoxideerd substraat gedurende de tijd vanaf de applicatie van TMB op het sensoroppervlak tot het initiëren van het reader-algoritme, bereikt de stroomloop vervolgens snel een stabiele toestand, waardoor binnen 60 seconden betrouwbaar accurate sensorwaarden kunnen worden verkregen.

De variabiliteit tussen sensoren is relatief constant, waardoor het mogelijk is om 16 verschillende sensor-assays parallel uit te voeren op de Gene Fluidic 16 sensor array chip. Positieve en negatieve controles zijn essentieel; als positieve controle wordt een synthetisch overbruggend DNA-oligonucleotide gebruikt dat hybridiseert met zowel de capture- als de detector-probes en dient als een synthetisch target van bekende concentratie. De resultaten die met het overbruggende oligonucleotide worden behaald, fungeren als een interne kalibratiecontrole om variaties tussen chips te minimaliseren.

Hoe groter de negatieve stroom van de elektrode, hoe hoger het signaal. Bij het testen van capture- en detector-probes moet de detectielimiet worden bepaald door de seriële verdunning van een monster met een bekende concentratie; zoals in deze figuur wordt getoond, is er een lineaire log-log correlatie tussen de monsterconcentratie en de signaaloutput over het dynamische bereik van de assay.

In deze staafdiagrammen worden de representatieve resultaten getoond voor monsters die Escherichia coli, Klebsiella spp. en ammoniak bevatten, welke frequent worden aangetroffen in de urine van patiënten met een urineweginfectie. De signalen voor de meeste sensoren zullen laag en vergelijkbaar zijn; deze negatieve resultaten kunnen worden samengevoegd als het achtergrondsignaal. De reactiviteit met het KE-sondepaar onderscheidt Klebsiella van E. coli. Het overbruggende oligonucleotide dient als positieve controle en interne kalibratiestandaard. Deze techniek kan worden toegepast voor de detectie van antibioticaresistente bacteriën in klinische monsters door de fenotypische respons van de bacteriën op antibiotica te meten.

Deze techniek kan worden gebruikt om de optimale therapie voor een individuele patiënt te bepalen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe bacteriën kunnen worden opgespoord en geïdentificeerd door de atric-stromen in de verschillende soortspecifieke sensoren in de chip te vergelijken.