Analyse van celsuspensies Geïsoleerd van vaste weefsels door Spectral flowcytometrie
5 mei 2017
Dit artikel beschrijft spectrale cytometry, een nieuwe benadering flowcytometrie dat de vormen van emissiespectra gebruikt om fluorochromen onderscheiden. Een algoritme vervangt vergoedingen en kan de behandeling van auto-fluorescentie als een onafhankelijke parameter. Deze nieuwe aanpak maakt het mogelijk voor een juiste analyse van de cellen geïsoleerd van vaste organen.
Het algemene doel van deze spectrale cytometrietechniek is om verschillende fluorochromen te onderscheiden met behulp van hun volledige emissiespectra. Bovendien maakt dit protocol de implementatie van autofluorescentie mogelijk als een onafhankelijke parameter, waardoor een goede analyse mogelijk is van cellen geïsoleerd uit vaste organen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van immunologie en de ontwikkeling van stamcelbiologie, zoals hoe zeldzame celpopulaties te identificeren.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de unieke capaciteit om tegelijkertijd een groot aantal parameters te analyseren en de autofluorescentie van vast weefsel te beheren. Hoewel deze methode wordt gebruikt voor de bereiding van een enkele celsuspensie afgeleid van darm en hart, kan deze ook worden toegepast op andere organen, zoals long, skeletspier, lever, vet en nier. Om te beginnen isoleer en was de dunne darm van een volwassen muis.
Leg vervolgens het weefsel op een papieren handdoek en verwijder voorzichtig met scherpe schaar de Peyer's patches. Open de darm door hem longitudinaal te snijden en verdeel hem in stukken van één centimeter. Breng vervolgens het weefsel over in een beker gevuld met 30 milliliter HBSS aangevuld met tien procent FCS en incubeer het gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius met constant roeren.
Zodra de incubatie is voltooid, breng de celsuspensie over in een 15 milliliter plastic buis en vortex deze gedurende vijf minuten krachtig. Incubeer vervolgens de suspensie gedurende tien minuten op ijs om grote, niet-gedissocieerde fragmenten te laten sedimenteren. Transfer daarna het supernatant naar een nieuwe buis en centrifugeer de cellen gedurende zeven minuten bij 120 keer G.
Nadat de pellet is gevormd, suspenderen we de cellen in tien milliliter één procent FCS in HBSS en tellen ze met behulp van een Neubauer kamer. Voorafgaand aan het kleuren van de cellen, breng één maal tien tot de zesde intestinale cellen over naar een vijf milliliter buis om een negatieve controle voor te bereiden. Om een monster voor te bereiden, voeg één maal tien tot de zesde van intestinale cellen toe, gevolgd door twee milliliter HBSS met één procent FCS in een nieuwe vijf milliliter buis en centrifugeer de suspensie bij 120 keer G, bij vier graden Celsius, gedurende vijf minuten.
Na het weggooien van het supernatant, suspenderen we de cellen in 50 microliter van de antilichaamoplossing. Wikkel de buis in aluminiumfolie en incubeer de cellen gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Zodra de incubatie is voltooid, voeg twee milliliter één procent FCS in HBSS toe aan het monster en centrifugeer het gedurende vijf minuten bij 120 keer G, vier graden Celsius.
Gooi het supernatant weg en suspendeer de pellet in 200 microliter van een 0,5 microgram per milliliter propidiumjodideoplossing. Nadat een muizenembryo is onthoofd, week je lichaam in een petrischaal, bekleed met een vooraf bevochtigde papieren handdoek, en gevuld met 50 milliliter één procent FCS in HBSS. Onder een stereomicroscoop maak je een incisie aan de rechterkant van de borst van het embryo en open je voorzichtig de thorax, waarbij je het hart niet beschadigt.
Grijp de grote bloedvaten en trek het hart dat verbonden is met de longen en de thymus eruit. Breng de organen over in een 35 milliliter petrischaal gevuld met twee milliliter één procent FCS in HBSS. Isoleer vervolgens het hart van de omliggende organen en bindweefsel.
Na het wassen van het hart, week het in één milliliter voorverwarmde enzymatische oplossing en snipper het orgaan in stukken van één kubieke millimeter onder een stereomicroscoop met behulp van fijne pincetten en een scalpel. Voeg een extra milliliter voorverwarmde enzymatische oplossing toe en breng het versnipperde weefsel over in een afgesloten vijf milliliter buis. Incubeer het monster horizontaal gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius.
Zodra de incubatie is voltooid, homogeniseer het weefsel door repetitieve pipettering van de suspensie met een P1000 pipet. Zet vervolgens de monsters, verticaal gepositioneerd, opzij totdat de fragmenten van het onverteerde weefsel zijn gezakt. Breng het supernatant over in een 50 milliliter buis.
Voeg twee milliliter tien procent FCS in HBSS toe en bewaar de geïsoleerde cellen op ijs. Voeg vervolgens twee milliliter voorverwarmde enzymatische oplossing toe aan de vijf milliliter buis die het onverteerde weefselsediment bevat, en blijf het weefsel verteren zoals eerder is aangegeven totdat er geen resterend weefsel meer is waargenomen. Centrifugeer de verkregen celsuspensie gedurende tien minuten bij 120 keer G.
Gooi vervolgens het supernatant weg en suspendeer de cellen in één milliliter één procent FCS in HBSS, vrij van calcium- en magnesiumkationen. Om de hartcellen te kleuren, breng 200 microliter van de celsuspensie over in putjes van een rondbodem 96-putjesplaat. Centrifugeer de plaat gedurende één minuut bij 480 keer G en gooi het supernatant weg.
Resuspendeer vervolgens de hartcellen in 100 microliter van de antilichaamoplossing. Wikkel de plaat in aluminiumfolie en incubeer deze gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Zodra de incubatie is voltooid, was de hartcellen met 200 microliter één procent FCS in calcium- en magnesiumvrij HBSS en centrifugeer de suspensie gedurende één minuut bij 480 keer G.
Resuspendeer vervolgens de cellen in 200 microliter één procent FCS in HBSS, vrij van calcium- en magnesiumionen, en breng de suspensie over in een vijf milliliter buis vooraf gevuld met 200 microliter één procent FCS in calcium- en magnesiumvrij HBSS. Voeg tenslotte 400 microliter één procent FCS in HBSS toe, vrij van calcium- en magnesiumkationen, met 0,5 microgram per milliliter propidiumjodide en filter de celsuspensie door een 70 micro nylon gaas. Om de cellen te visualiseren, laad je het gekleurde monster naar een flowcytometer en klik je op preview, en neem vervolgens maximaal twee maal tien tot de zesde gebeurtenissen in het monster op door te klikken op acquire.
In het analysetabblad open je het kleurpalletvenster en registreer je alle bestudeerde parameters door de fluorochroom samen met de bijbehorende marker
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel bespreekt spectrale cytometry, een nieuwe techniek in flowcytometrie die gebruikmaakt van de vormen van emissiespectra om fluorochromen te differentiëren. Deze methode maakt een onafhankelijke behandeling van autofluorescentie mogelijk, wat een nauwkeurige analyse van cellen uit solide organen faciliteert.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Flowcytometrie
- Immunologie
- Stamcelbiologie
Achtergrond
- Spectrale cytometrie onderscheidt fluorochromen aan de hand van hun volledige emissiespectra.
- Het maakt de analyse van autofluorescentie als een onafhankelijke parameter mogelijk.
- Deze techniek is toepasbaar op diverse solide organen.
- Het helpt bij het identificeren van zeldzame celpopulaties.
Doel van de studie
- Om de analyse van cellen die uit solide organen zijn geïsoleerd te verbeteren.
- Om de identificatie van verschillende fluorochromen te verbeteren.
- Om de studie van complexe biologische vraagstukken te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Isolatie en wassen van de dunne darm van volwassen muizen.
- Bereiding van single-cell suspensies uit diverse organen.
- Toepassing van spectrale cytometry-technieken.
- Analyse van autofluorescentie in solide weefsels.
Belangrijkste resultaten
- De techniek maakt gelijktijdige analyse van meerdere parameters mogelijk.
- Het beheerst effectief autofluorescentie in vaste weefsels.
- Toepasbaar op organen zoals de long, lever en nieren.
- Ondersteunt onderzoek in de immunologie en stamcelbiologie.
Conclusies
- Spectrale cytometrie vormt een aanzienlijke vooruitgang ten opzichte van flowcytometrie.
- Het biedt een robuuste methode voor de analyse van complexe celpopulaties.
- Deze techniek kan ons begrip van diverse biologische processen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Spectrale flowcytometrie pakt een kritiek knelpunt in de immunologie en stamcelonderzoek aan door hoogdimensionale analyse van celsuspensies uit solide weefsels mogelijk te maken zonder dat compensatie vereist is. Deze mogelijkheid verbetert de detectie van zeldzame populaties en vermindert misclassificatie als gevolg van autofluorescentie, wat direct bijdraagt aan targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase. De methode verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid bij het onderzoeken van complexe biologische systemen, zoals immuuninfiltraten in de darmen en het hart.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door fluorochroom-overlap en autofluorescentie in digesten van solide organen op te lossen.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door middel van 21-parameter profilering van immuun- en stromale compartimenten.
- Strategische waarde: Verbetert de triage van de portfolio door het vertrouwen in de read-outs van target-engagement en padmodulatie te vergroten.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde enkelcel-suspensies voor uit darm, hart, long, lever en nier voor integratie in downstream-assays.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten door autofluorescentie te behandelen als een meetbare parameter in plaats van als ruis.
- Strategische waarde: Maakt schaalbare workflows voor compound-screening mogelijk met verminderde batchvariabiliteit in modellen van solide weefsel.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de relevantie voor de ziekte door natuurlijke weefselfenotypen te preserveren tijdens enzymatische dissociatie en kleuring.
- Operationele waarde: Garandeert continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via gestandaardiseerde protocollen voor celpreparatie en acquisitie.
- Strategische waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde vooruitgang door mechanische ambiguïteit in complexe weefsels te verduidelijken.
Integratie van Pipeline & Workflow
Spectrale flowcytometrie past binnen het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing in primaire weefsels tot de identificatie van lead-kandidaten via immuunprofilering, vooral wanneer conventionele flowcytometrie tekortschiet door spectrale overlap of hoge autofluorescentie.
- Discovery Biology: Faciliteert pathway-verduidelijking en biologische risicoreductie door high-resolution fenotypering van zeldzame celpopulaties in solide organen mogelijk te maken.
- Screening: Zorgt voor assay-klaarheid via gestandaardiseerde isolatie van levensvatbare cellen uit de darm en het hart, met toepasbaarheid op andere organen.
- Analytics: Genereert multi-parametrische data zonder compensatie, waardoor directe vergelijking van kleuringscondities en marker-expressie mogelijk is.
- Translational Research: Verbindt met preklinisch werk door weefselafgeleide cellulaire toestanden te behouden voor functionele follow-up.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor immunofenotypering over meerdere ziektemodellen en organsystemen.
Operationele impact en impact op de onderneming
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door populaties te onderscheiden die door autofluorescentie worden vertroebeld.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie tussen laboratoria door middel van gedefinieerde workflows voor dissociatie en kleuring.
- Strategische waarde: Vermindert biologische risico's in een laat stadium door de vroege detectie van off-target immuuninteracties te verbeteren.
- Impact op portfolio: Maakt datagedreven go/no-go beslissingen mogelijk op basis van getrouwe immuunprofilering uit klinisch relevante weefsels.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in flowcytometrie, enzymatische weefseldissociatie en multi-panel antilichaamkleuring.
- Is afhankelijk van toegang tot een spectrale flowcytometer met unmixing-software en geschikte filtratie-instellingen.
- Necessiteert cross-team standaardisatie van weefselpreparatieprotocollen om viabiliteit en consistentie te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het uitbreiden van de methode naar vezelige of vette weefsels, zoals long- of vetweefsel.
- Bevat praktische beperkingen met betrekking tot weefselspecifieke autofluorescentieniveaus en de optimalisatie van de enzymatische digestie.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
9:50
Conclusion
8:44
Results: Spectral Cytometry-based Characterization of Embryonic Cardiac Cells
1:07
Intestinal Cells Isolation
2:20
Cell Staining
3:26
Preparation of Cell Suspension from Embryonic Mouse Heart
5:31
Cardiac Cell Staining
6:54
Data Acquisition and Analysis
