Wezenlijke Microbiome Dynamics – Stroom Cytometry gebaseerd werkstromen van reinculturen aan natuurlijke gemeenschappen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in microbiële ecologie en biotechnologie, bijvoorbeeld welke ecologische concepten een bepaald ecosysteem aansturen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om de snelle microbioomdynamiek te volgen met het korte intervalbemonsteringsregime, terwijl het zeer kosteneffectief blijft. Deze methode kan worden gebruikt om informatie te verkrijgen over biotechnologische en natuurlijke microbiële gemeenschappen en ook op dierlijke en menselijke microbiomen voor voedings- en gezondheidstoestanden.

De procedure wordt gedemonstreerd door Florian Schattenberg, technicus en SediMeter-operator in ons laboratorium. Om een biogasgemeenschapsmonster te drogen, gebruikt u een aangepaste pipettip van één milliliter om 200 microliter van het stroperige digestaat over te brengen naar een buisje van twee milliliter dat 1,7 milliliter PBS bevat. Na grondig mengen, plaatst u de buisjes een minuut in een ultrasone bad om eventuele grote celaggregaten te ontbinden en cellen die aan plantencelresidu's plakken los te maken.

Na het bewerken met ultrasone trillingen, mengt u het monster grondig en filtert u de cellen door een zeef met poriën van 50 micrometer in een plastic buisje van 2 milliliter. Verdeel het filtraat in vier fracties van 400 microliter en centrifugeert u de fracties twee keer, waarbij u beide keren het supernatant volledig weggooit om het microbemonster zo grondig mogelijk mechanisch uit te drogen. Droog vervolgens het monster in een verwarmde vacuümcentrifuge om een stabiel pellet te creëren en bewaar het pellet op vier graden Celsius, beschermd tegen licht.

Voor stabilisatie en fixatie van actieve slibmonsters, centrifugeert u vier milliliter van de cellen en suspendeert u het pellet opnieuw in vier milliliter van twee procent formaldehyde in PBS. Na 30 minuten bij kamertemperatuur, centrifugeert u het gestabiliseerde celmonster en fixeert u het pellet in vier milliliter 70% ethanol voor opslag bij minus 20 graden Celsius. Meng en breng 0,6 milliliter van de gefixeerde celsuspensie over in een glazen buisje met 1,4 milliliter PBS en soniceer na grondig mengen gedurende 10 minuten, zoals gedemonstreerd.

Aan het einde van het bewerken met ultrasone trillingen, verzamelt u de cellen door centrifugatie en suspendeert u het pellet opnieuw in twee milliliter vers PBS. Na grondig mengen, soniceer de cellen zoals zojuist gedemonstreerd gedurende vijf minuten en pas de OD 700 nanometer aan 035 aan met vers PBS. Verzamel de cellen door centrifugatie en suspendeert u het pellet in één mililiter van een permeabilisatiebuffer met 0,11 molair citroenzuur en 4,1 milimolair tween 20, met grondig mengen, gedurende 20 minuten incubatie bij kamertemperatuur.

Verzamel vervolgens de cellen door centrifugatie en suspendeer het pellet grondig in twee mililiter van een kleuroplossing met 0,68 micromolair DAPI, voor minimaal 60 minuten incubatie bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Voor bead-kalibratie, laadt u de beadmix voor lineaire kalibratie in de flowcytometer en meet u de beads continu terwijl u de nozzle- en laseropticaposities manipuleert om het instrument in het lineaire bereik vooraf te kalibreren. Wanneer de beadpieken in een vooraf ingesteld kalibratiesjabloon passen, schakelt u over naar log-modus en laadt u een logaritmische kalibratie-beadmonster.

Pas de logaritmische beadpieken aan aan hun vooraf ingestelde kalibratiesjabloon om de hardware van het instrument te verfijnen en gebruik de photomultiplierbuisversterkerinstelling om eventuele noodzakelijke eindaanpassingen aan de beadpositie te maken. Het meest cruciale aspect van deze procedure is het handhaven van consistente metingen om vergelijkbaarheid tussen experimenten mogelijk te maken. Daarom zijn dagelijkse cytometerkalibratie en het gebruik van beads in de biologische stum-lids essentieel voor het succes van langzame cytomische microbioomdialyse. Wanneer de cellen klaar zijn, mengt u en filtert u de monsters en voegt u de logaritmische beadmix toe aan de cellen.

Meng en laad nu het monster op de cytometer en maak een poort om de gekleurde cellen op te nemen en het geluid en de beads uit te sluiten. Analyseer vervolgens de monsters achtereenvolgens met een maximale snelheid van 3.000 gebeurtenissen per seconde totdat 250.000 cellen worden gedetecteerd binnen de celpoort. Om de flowcytometriegegevens te analyseren, ontwikkelt u een master poortsjabloon voor gebruik op alle monsters.

Begin met het laden van de flowcytometriestandaardbestanden in een geschikt flowcytometrieanalyseprogramma en verwerk de monsters achtereenvolgens. Laad de monsters, klik dubbel op een meting en selecteer de X- en Y-asparameters, uit hun respectievelijke vervolgkeuzemenu's om een voorwaartse verstrooiing versus DAPI-fluorescentieplot te openen. Gebruik het polygoontekengereedschap om de eerder gegenereerde meetcelpoort te reproduceren om de beads en het geluid uit te sluiten en noem de poort dienovereenkomstig.

Sleep de celpoortingang naar de groepslijst van alle monsters en klik dubbel op de celpoort om alleen de celgebeurtenissen selectief weer te geven. Definieer de subgemeenschappen die in een monster prevalent zijn met het elliptische poortgereedschap en pool ze. Voeg vervolgens extra subgemeenschapsallocaties en volgende monsters toe totdat de master poortsjabloon past op alle monsters.

Beheers de sjabloon van de master poort met de zijverstrooiingscanmethode om subgemeenschappen die dicht bij elkaar clusteren op te lossen. Voeg vervolgens alle subgemeenschappen toe aan de tabeleditor en stel de uitvoerstatistiek in op frequentie van ouder. Gebruik de tabeleditor om de relatieve subgemeenschapsabundanties te exporteren naar een geschikte spreadsheetsoftware en pas de gegevensopmaak aan volgens de richtlijnen in de zijbalkhandleiding.

Vervolgens, om de dynamischen en correlaties van de subgemeenschap te visualiseren, installeert u en laadt u het R-pakket en laadt en normaliseert u het txt-bestand. Voorwaartse verstrooiing versus DAPI-fluorescentieplots onthullen de celcyclustoestanden van pure stamculturen op verschillende punten in een batchcultuur. Het gebruik van een master poortsjabloon maakt het mogelijk om de verhouding van cellen met één, twee of meerdere chromosomen te kwantificeren, wat bijvoorbeeld de mogelijkheid van deze representatieve microbe om zijn chromosomen sn